[發明專利]一組GH10家族耐高溫木聚糖酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202110854745.4
• 申請日: 2021-07-28
• 公開（公告）號: CN113444707B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 游帥;陳忠立;莊愉;儲呈平;葛研;王俊
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;A23K20/189;C12R1/84
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

一組GH10家族耐高溫木聚糖酶突變體及其應用,所述突變體為HwXyl10A?G363R、HwXyl10A?T324V、HwXyl10A?N318W和HwXyl10A?N318W/G363R/T324V突變體；四種突變體在75℃下的半衰期較野生型分別延長了12min、20min、24min和38min。這樣一種在動物體溫下催化活力高、熱穩定性優良的木聚糖酶，在飼料添加及生物質降解中有著極大的應用潛力。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一組GH10家族耐高溫木聚糖酶突變體及其應用。

背景技術

現有的飼料一般以玉米、麩皮、小麥或稻谷等作為主要原料，其中含有相當量的非淀粉類多糖，其中包括纖維素、半纖維素、果膠等。纖維素是由D-吡喃式葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的大分子聚合物，也是植物細胞壁的主要成分。半纖維素一般指自然界植物細胞壁中除果膠和纖維素類成分之外的其他聚糖類物質，主要包括木聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。木聚糖的結構非常復雜，主鏈由吡喃木糖通過β-1,4-D-木糖苷鍵連接而成，聚合度在150-200之間，側鏈含有多種形式的取代基或取代基團，常見的取代基包括阿拉伯糖、葡萄糖酸、半乳糖、阿魏酸、乙酸以及香豆酸等(Kulkarni et al.,1999；Liab etal.,2000；Squina et al.,2009)。但是由于非反芻類動物缺少降解非淀粉類多糖的酶類，其自身極難消化半纖維素而容易形成糜狀積食，影響動物腸道的內環境。一方面，導致動物腸道微生物種群類型的改變，另一方面，糜狀積食會影響動物對飼料的吸收，使得飼料利用率大幅降低，增加了投喂飼料的成本。

在飼料中添加合適的木聚糖酶，可以破碎植物細胞的細胞壁，造成半纖維素的水解，釋放細胞內容物，從而達到降低食糜粘度的目的，極大的提高飼料利用率，降低飼料成本。而木聚糖的水解產物為寡糖，其中的木二糖具有卓越的保健功能：1)抗齲齒；2)降血脂、降血壓、降血糖；3)促進礦物質吸收；4)增殖雙歧桿菌，雙歧桿菌具有抑菌、增強免疫和改善維生素代謝的作用。

然而，在工業生產制備飼料的過程中，其工作環境溫度較高，并且在飼料高壓制粒過程中，伴隨著瞬時高溫，因此需要木聚糖酶具備優良的熱穩定性，在極端高溫的環境下仍具備活性。盡管木聚糖酶在自然界中分布極廣，但具備耐高溫特性的木聚糖酶并不多。其中微生物來源的木聚糖酶是目前實際應用和研究中最常用的材料。但它們大都無法兼顧熱穩定性和催化活力，并且由于天然微生物的特性，它們往往無法大量表達木聚糖酶。

針對自然來源木聚糖酶的篩選難、性質差等問題，對自然界的酶采取理性、半理性或隨機定向進化、突變、區段重組、構建雜合體以及活性位點突變技術等方法進行研究，并且構建高表達工程菌株，是當下改造并獲得優良木聚糖酶的主要途徑。

發明內容

解決的技術問題：本發明提供一組GH10家族耐高溫木聚糖酶突變體及其應用。該組突變體來源于真菌Hortaea werneckii的木聚糖酶HwXyl10a，通過同源序列比對和結構分析，理性設計定向改良木聚糖酶HwXyl10A的熱穩定性，使其適用于工業生產。

技術方案：一組GH10家族耐高溫木聚糖酶突變體，所述突變體為HwXyl10A-G363R、HwXyl10A-T324V、HwXyl10A-N318W和HwXyl10A-N318W/G363R/T324V突變體；所述HwXyl10A-G363R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；HwXyl10A-T324V的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；HwXyl10A-N318W的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；HwXyl10A-N318W/G363R/T324V的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述HwXyl10A-G363R的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；HwXyl10A-T324V的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；HwXyl10A-N318W的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；HwXyl10A-N318W/G363R/T324V的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。