[發明專利]一種發酵生產尼克酰胺磷酸核糖轉移酶的方法

有效

• 申請號: 202110848348.6
• 申請日: 2021-07-27
• 公開（公告）號: CN113699128B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 岳明瑞;曹華杰;謝沛;郭永勝;滕義衛
• 申請（專利權）人: 新泰市佳禾生物科技有限公司;汕頭市佳禾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N1/21;C12N15/54;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發明公開了一種發酵生產尼克酰胺磷酸核糖轉移酶的方法，屬于生物工程技術領域。包括以下步驟：(1)將NAMPT生產菌株接種至培養基中進行發酵培養，所述發酵培養條件為：發酵溫度32℃?34℃、溶氧20?40％、發酵培養時間5?8h；(2)將發酵體系的溫度降至21℃?23℃，加入IPTG進行誘導培養20?30h，即生產得到NAMPT。采用本發明的方法可以實現NAMPT的大規模、工業化生產。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種發酵生產尼克酰胺磷酸核糖轉移酶的方法。

背景技術

尼克酰胺磷酸核糖轉移酶(nicotinamide?phosphoribosyl?transferase，NAMPT)是NAD補救合成通路的限速酶，通過合成NAD參與細胞物質和能量代謝、蛋白質修飾、DNA修復等重要過程。對于NAMPT的前期研究主要集中于衰老、免疫應答、炎癥反應、糖尿病、氧化應激、代謝方面。近期研究發現NAMPT在惡性腫瘤中表達升高，推測其可能是潛在的治療靶點之一。NAMPT成為抗腫瘤治療策略研究熱點之一，其生物學功能被不斷發掘利用。

因此，NAMPT具有廣泛的應用價值，需求量不斷增加。但目前還很少見有通過發酵法大規模生產NAMPT的報道。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種發酵生產尼克酰胺磷酸核糖轉移酶的方法。采用本發明的方法可以實現NAMPT的大規模、工業化生產。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種發酵生產尼克酰胺磷酸核糖轉移酶的方法，包括以下步驟：

(1)將NAMPT生產菌株接種至發酵培養基中進行培養，初始發酵溫度為32-34℃，攪拌轉速為200-400rpm，發酵過程中控制溶氧為20-40％，pH值為6.8-7.2；發酵培養至發酵液稀釋100倍后的OD₆₀₀值為0.18-0.20；

(2)將發酵體系的溫度降至21℃-23℃，加入IPTG，同時流加補料，調控補料的流加速度使發酵體系的溶氧控制在20-40％，誘導培養20-30h，即生產得到含有NAMPT酶的發酵液。

優選的，步驟(1)中，所述NAMPT生產菌株由如下方法構建而成：

將SEQ?ID?NO.1所示的編碼NAMPT的核苷酸片段連入質粒pLLP-ompA，獲得第一重組表達載體；將SEQ?ID?NO.2所示的編碼PARP1的核苷酸片段連入質粒pET-42a(+)，獲得第二重組表達載體；再將獲得的第一重組表達載體和第二重組表達載體導入大腸桿菌，即構建得到NAMPT生產菌株。

本發明在構建NAMPT生產菌株時，將表達NAMPT的重組表達載體和表達PARP1的重組表達載體同時導入到大腸桿菌中，通過少量PARP1的表達，可以顯著提高NAMPT的表達量。

優選的，步驟(1)中，所述發酵培養基的組成為：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化鈉3g/L，硫酸銨2.5g/L，三水磷酸氫二鉀4g/L，檸檬酸鐵銨0.3g/L，檸檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸鎂0.5g/L。

優選的，步驟(2)中，加入IPTG，使IPTG在發酵體系中的終濃度為0.5mmol/L。

優選的，步驟(2)中，所述補料由甘油和水按體積比1:1配制而成。

優選的，步驟(2)中，補料的加入量為發酵培養基重量的10-20％。

本發明的有益效果：

(1)本發明對原核表達NAMPT的生產菌株進行了優化，將表達NAMPT的重組表達載體和表達PARP1的重組表達載體同時導入到大腸桿菌中，通過少量PARP1的表達，可以顯著提高NAMPT的表達量。