[發(fā)明專利]一種發(fā)酵生產(chǎn)尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110848348.6
• 申請日: 2021-07-27
• 公開（公告）號(hào): CN113699128B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 岳明瑞;曹華杰;謝沛;郭永勝;滕義衛(wèi)
• 申請（專利權(quán)）人: 新泰市佳禾生物科技有限公司;汕頭市佳禾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N1/21;C12N15/54;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南譽(yù)豐專利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發(fā)明公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。包括以下步驟：(1)將NAMPT生產(chǎn)菌株接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度32℃?34℃、溶氧20?40％、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間5?8h；(2)將發(fā)酵體系的溫度降至21℃?23℃，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)20?30h，即生產(chǎn)得到NAMPT。采用本發(fā)明的方法可以實(shí)現(xiàn)NAMPT的大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的方法。

背景技術(shù)

尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide?phosphoribosyl?transferase，NAMPT)是NAD補(bǔ)救合成通路的限速酶，通過合成NAD參與細(xì)胞物質(zhì)和能量代謝、蛋白質(zhì)修飾、DNA修復(fù)等重要過程。對于NAMPT的前期研究主要集中于衰老、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、糖尿病、氧化應(yīng)激、代謝方面。近期研究發(fā)現(xiàn)NAMPT在惡性腫瘤中表達(dá)升高，推測其可能是潛在的治療靶點(diǎn)之一。NAMPT成為抗腫瘤治療策略研究熱點(diǎn)之一，其生物學(xué)功能被不斷發(fā)掘利用。

因此，NAMPT具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，需求量不斷增加。但目前還很少見有通過發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)NAMPT的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的方法。采用本發(fā)明的方法可以實(shí)現(xiàn)NAMPT的大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種發(fā)酵生產(chǎn)尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的方法，包括以下步驟：

(1)將NAMPT生產(chǎn)菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，初始發(fā)酵溫度為32-34℃，攪拌轉(zhuǎn)速為200-400rpm，發(fā)酵過程中控制溶氧為20-40％，pH值為6.8-7.2；發(fā)酵培養(yǎng)至發(fā)酵液稀釋100倍后的OD₆₀₀值為0.18-0.20；

(2)將發(fā)酵體系的溫度降至21℃-23℃，加入IPTG，同時(shí)流加補(bǔ)料，調(diào)控補(bǔ)料的流加速度使發(fā)酵體系的溶氧控制在20-40％，誘導(dǎo)培養(yǎng)20-30h，即生產(chǎn)得到含有NAMPT酶的發(fā)酵液。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述NAMPT生產(chǎn)菌株由如下方法構(gòu)建而成：

將SEQ?ID?NO.1所示的編碼NAMPT的核苷酸片段連入質(zhì)粒pLLP-ompA，獲得第一重組表達(dá)載體；將SEQ?ID?NO.2所示的編碼PARP1的核苷酸片段連入質(zhì)粒pET-42a(+)，獲得第二重組表達(dá)載體；再將獲得的第一重組表達(dá)載體和第二重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，即構(gòu)建得到NAMPT生產(chǎn)菌株。

本發(fā)明在構(gòu)建NAMPT生產(chǎn)菌株時(shí)，將表達(dá)NAMPT的重組表達(dá)載體和表達(dá)PARP1的重組表達(dá)載體同時(shí)導(dǎo)入到大腸桿菌中，通過少量PARP1的表達(dá)，可以顯著提高NAMPT的表達(dá)量。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化鈉3g/L，硫酸銨2.5g/L，三水磷酸氫二鉀4g/L，檸檬酸鐵銨0.3g/L，檸檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸鎂0.5g/L。

優(yōu)選的，步驟(2)中，加入IPTG，使IPTG在發(fā)酵體系中的終濃度為0.5mmol/L。

優(yōu)選的，步驟(2)中，所述補(bǔ)料由甘油和水按體積比1:1配制而成。

優(yōu)選的，步驟(2)中，補(bǔ)料的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的10-20％。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明對原核表達(dá)NAMPT的生產(chǎn)菌株進(jìn)行了優(yōu)化，將表達(dá)NAMPT的重組表達(dá)載體和表達(dá)PARP1的重組表達(dá)載體同時(shí)導(dǎo)入到大腸桿菌中，通過少量PARP1的表達(dá)，可以顯著提高NAMPT的表達(dá)量。