[發明專利]一種豌豆根瘤菌RL3841菌株突變株的構建方法及應用

有效

• 申請號: 202110844866.0
• 申請日: 2021-07-26
• 公開（公告）號: CN113621547B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: 程國軍;羅莎;鄒倩;胡愛奇;陳曉紅;龍松華;李曉華;何冬蘭;閻春蘭
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;C12R1/41
• 代理公司: 武漢華旭知識產權事務所 42214
• 代理人: 高劍鋒

1.一種豌豆根瘤菌RL3841菌株突變株，其特征在于：通過將質粒pJQemrRΩSpe導入豌豆根瘤菌RL3841菌株中得到。

2.根據權利要求1所述豌豆根瘤菌RL3841菌株突變株的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1.根據種豌豆根瘤菌RL3841菌株的emrR基因序列設計引物，擴增得到目的片段；

步驟2.將質粒pMD-19T與目的片段連接后轉化導入感受態細胞DH5α，抗性篩選，挑取單菌落轉化子酶切后，測序驗證得到陽性克隆質粒pMDemrR；

步驟3.將質粒pPH45ΩSpe用Sma I單酶切后獲得的ΩSpe片段與經過fsp I單酶切后的pMDemrR進行連接，轉化導入感受態細胞DH5α，抗性篩選，挑取單菌落轉化子酶切，驗證篩選得到陽性克隆質粒pMDemrRΩSpe；

步驟4.將pMDemrRΩSpe質粒用Xba I和Xho I進行雙酶切后獲得的emrRΩSpe片段與經過Xba I和Xho I雙酶切后pJQ200SK質粒酶連并轉化感受態細胞DH5α抗性篩選，挑取單菌落轉化子酶切，測序驗證獲得陽性克隆質粒pJQemrRΩSpe；

步驟5.通過三親本接合，將供體菌pJQemrRΩSpe導入豌豆根瘤菌RL3841菌株中，經過抗性初篩、蔗糖致死復篩及慶大霉素抗性排除假陽性，挑取單菌落重組子，進行菌落PCR驗證，構建豌豆根瘤菌RL3841菌株突變株即豌豆根瘤菌RLemrR。

3.根據權利要求2所述豌豆根瘤菌RL3841菌株突變株的構建方法，其特征在于，步驟1中引物為：

5’AAAAAGCTTCTATTACGGCCATGATTACT3’

以及5’AAATCTAGATTGCATAGGAAAGGTTGAGC3’。

4.根據權利要求2所述豌豆根瘤菌RL3841菌株突變株的構建方法，其特征在于，步驟5中進行菌落PCR驗證所用引物為：

ΩSpe特異引物5’CGGTTTACAAGCATAAAGC3’

以及豌豆根瘤菌RL3841基因組引物5’CCTAGATGCCGGCAAGACGC3’。

5.根據權利要求2-4中任一項所述構建方法在提高豌豆根瘤菌環境適應能力和/或結瘤效率中的應用。

6.根據權利要求5中所述的應用，其特征在于：所述提高環境適應能力為提高對十二烷基硫酸鈉、過氧化氫、過氧化氫異丙苯和結晶紫的抗性。

7.根據權利要求5中所述的應用，其特征在于：所述提高結瘤效率為提高共生結瘤和競爭結瘤能力。