[發(fā)明專利]一種檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身抗體的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110831912.3
• 申請(qǐng)日: 2021-07-22
• 公開（公告）號(hào): CN113567660A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅帥寒天;譚怡忻;黃馨;武瑞芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/533
• 分類號(hào): G01N33/533;G01N33/537;G01N33/543
• 代理公司: 蘇州拓云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32344
• 代理人: 王云峰

1.一種檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身抗體的方法，其特征在于，主要用于檢測(cè)抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體和抗核抗體，其具體步驟如下：

S1、分別制備雙鏈DNA抗原包被的磁微粒、Sm抗原包被的磁微粒和核小體抗原包被的磁微粒，分別加入熒光劑標(biāo)記后的鼠抗人免疫球蛋白，分別得到雙鏈DNA抗體檢測(cè)混合制劑、Sm抗體檢測(cè)混合制劑和抗核抗體檢測(cè)混合制劑，冷藏備用；

S2、制備稀釋劑：向Tris-HCl緩沖液中依次加入天冬氨酸、牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇、表面活性劑、氯化鈉溶液、防腐劑、酶抑制劑，混合后制得所述稀釋劑；

S3、分別向S1中制得的雙鏈DNA抗體檢測(cè)混合制劑、Sm抗體檢測(cè)混合制劑和抗核抗體檢測(cè)混合制劑中加入S2中所述的稀釋劑，使其保持活性，冷藏備用；

S4、取待檢測(cè)患者血清樣本，將其按照1∶500的比例稀釋，備用；

S5、準(zhǔn)備醋酸纖維素膜，將其裁剪為30cm×40cm，然后采用點(diǎn)樣儀將S3中加入稀釋劑后的雙鏈DNA抗體檢測(cè)混合制劑、Sm抗體檢測(cè)混合制劑和抗核抗體檢測(cè)混合制劑按照陣列排布點(diǎn)制在醋酸纖維素膜上，將S4中稀釋后的血清樣本點(diǎn)滴在醋酸纖維素膜上對(duì)應(yīng)的檢測(cè)樣點(diǎn)處，靜置15-20min；

S6、將S5中靜置后的醋酸纖維素膜于熒光檢測(cè)儀器下進(jìn)行檢測(cè)，即可獲得待檢測(cè)患者血清樣本中的雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體和抗核抗體情況。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身抗體的方法，其特征在于，S1中的具體方法為：取粒徑為0.05μm-0.1μm甲苯磺酰基納米磁珠懸浮液，磁分離后去除上清液，分裝與三個(gè)容器中，分別加入雙鏈DNA抗原、Sm抗原和核小體抗原，然后均加入濃度為5mmol/L-10mmol/L的硼酸銨溶液，于37℃下混懸24-36h，再次進(jìn)行磁分離，去除上清液，即分別得到所述的雙鏈DNA抗體檢測(cè)混合制劑、Sm抗體檢測(cè)混合制劑和抗核抗體檢測(cè)混合制劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身抗體的方法，其特征在于，所述S1中，對(duì)鼠抗人免疫球蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法為：將1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液、F1-Y030微球溶液、N-羥基琥珀酰亞胺溶液混合均勻并在35℃下反應(yīng)20分鐘，然后加入NaOH溶液，在pH計(jì)的檢測(cè)下將混合溶液的pH值調(diào)整到7.2-7.4之間，按照所需標(biāo)記比例將向混合溶液中加入待標(biāo)記的鼠抗人免疫球蛋白，在30℃下反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)后加入NH₄Cl溶液，同樣在30℃下靜置15分鐘，以終止反應(yīng)，然后進(jìn)行PBS緩沖液透析并回收混合溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身抗體的方法，其特征在于，S2中所述的稀釋劑中各組份的質(zhì)量百分比為：天冬氨酸5％-10％、牛血清白蛋白2％-8％、二硫蘇糖醇0.05％-0.1％、表面活性劑0.1％-0.3％、氯化鈉溶液10％-20％、防腐劑0.05％-0.15％、酶抑制劑0.1％-0.2％、余量為Tris-HCl緩沖液，其中氯化鈉溶液的濃度為0.3-0.4mol/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身抗體的方法，其特征在于，所述S2中：二硫蘇糖醇可采用三(2-羧乙基)膦進(jìn)行等量替換，酶抑制劑為蛋白酶抑制劑或RNA酶抑制劑中的任意一種，所述防腐劑為山梨酸鉀、苯甲酸鈉和亞硝酸鈉中的任意一種，所述其中氯化鈉溶液虧采用相同濃度的氯化鉀溶液進(jìn)行等量替換。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身抗體的方法，其特征在于：所述S3中，進(jìn)行冷藏備用的溫度為4℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身抗體的方法，其特征在于：所述S5中，將雙鏈DNA抗體檢測(cè)混合制劑、Sm抗體檢測(cè)混合制劑和抗核抗體檢測(cè)混合制劑按照陣列排布點(diǎn)制在醋酸纖維素膜上時(shí)，以3×4的陣列方式排布，按照三種抗體檢測(cè)試劑分為三排，每排排布四個(gè)檢測(cè)樣點(diǎn)，其中每相鄰兩個(gè)檢測(cè)樣點(diǎn)之間的間距為5-8cm。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身抗體的方法，其特征在于：在采用點(diǎn)樣機(jī)進(jìn)行點(diǎn)樣的過程中，每個(gè)檢測(cè)樣點(diǎn)應(yīng)當(dāng)重復(fù)進(jìn)行點(diǎn)樣3-4次。