[發明專利]一種檢測mRNA加帽效率的方法在審

申請號：	202110831299.5	申請日：	2021-07-22
公開（公告）號：	CN115678968A	公開（公告）日：	2023-02-03
發明（設計）人：	董翊潔	申請（專利權）人：	仁景（蘇州）生物科技有限公司
主分類號：	C12Q1/6813	分類號：	C12Q1/6813
代理公司：	北京紀凱知識產權代理有限公司 11245	代理人：	何葉喧
地址：	215000 江蘇省蘇州市自由貿易試驗區蘇州片區蘇州工***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種檢測 mrna 效率方法
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【說明書】：

本發明公開了一種檢測mRNA加帽效率的方法。本發明提供了一種檢測mRNA加帽效率的方法：(1)將供試mRNA與DNA探針雜交；(2)進行RNase酶解；(3)進行DNase酶解；(4)進行毛細管電泳，計算加帽效率。DNA探針為單鏈DNA分子，由15?25個核苷酸組成，與供試mRNA的5’UTR中的特異區段反向互補；特異區段位于供試mRNA的5’UTR的5’末端第10?85位核苷酸區間中。RNase具有特異性切割由DNA和RNA形成的雜合雙鏈中的RNA的功能。本發明為mRNA疫苗生產的質量控制提供一個高效、低成本的加帽率的快速測定方法，具有重要的開發價值和廣泛的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種檢測mRNA加帽效率的方法，尤其適用于mRNA疫苗的加帽效率的質控檢測。

背景技術

對于新型冠狀病毒的高突變，預防性疫苗的開發尤為重要。自病毒爆發以來，美國BioNtech/Pfizer和Moderna公司首次推出針對新冠病毒的mRNA疫苗，作為應對突發疫情的有效手段，mRNA疫苗獲得了FDA和EMA批準，目前已在北美和歐洲廣泛接種。mRNA疫苗是采用體外轉錄技術，依賴T7 RNA聚合酶以及DNA模板，在體外環境中轉錄出mRNA序列，可大量表達目的蛋白。mRNA的主要結構包括5’Cap、5’UTR、ORF區、3’UTR以及polyA尾(示意圖見圖1)，除了5’Cap，其他結構均可直接構建在質粒模版上，通過體外轉錄完成擴增，唯獨帽結構需要單獨連接在mRNA上。在真核細胞中，細胞會在自身轉錄出來的mRNA的5’端加入一個7-甲基鳥苷的帽子結構，即m7GPPPN結構，它能夠結合翻譯元件介導蛋白翻譯過程，同時防止mRNA被核糖核酸外切酶降解。

目前的RNA加帽方案主要有兩種方法：一種是通過牛痘病毒加帽酶以及甲基轉移酶對體外轉錄出來的mRNA進行Cap1修飾，該方法操作步驟多且成本較高；另一種是TriLink公司研發的CleanCap帽結構，可在體外轉錄反應過程中將其摻入至RNA，能形成94％含有Cap1結構的mRNA，該方法操作簡單成本相對較低，在未來具有廣闊的應用前景。

無論應用上述的任一方案，都存在一個加帽效率問題。加帽效率直接決定著mRNA的表達水平，所以在mRNA疫苗生產過程中需要實時監測每批產品加帽效率。目前，現有技術中檢測加帽效率的方法主要包括LC-MS檢測法以及qSL-RT-PCR法。LC-MS檢測法分析精度準，但實驗周期長、價格較高。qSL-RT-PCR法同樣存在操作周期較長的問題，而且精度較差。因此，開發一個操作周期較短、檢測靈敏度高的加帽效率檢測方法尤為重要。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測mRNA加帽效率的方法。

本發明提供了一種檢測mRNA加帽效率的方法，依次包括如下步驟：

(1)將供試mRNA與DNA探針雜交；

(2)進行RNase酶解；

(3)進行DNase酶解；

(4)進行毛細管電泳，計算加帽效率。

具體的，所述RNase為RNaseH。

所述方法中，供試mRNA和DNA探針的配比為：2μg：10-30pmol。

所述方法中，供試mRNA和DNA探針的配比為：2μg：20pmol。

所述方法中，供試mRNA、DNA探針、RNase、DNase的配比依次為：2μg：10-30pmol：4-6U：1-3U。

所述方法中，供試mRNA、DNA探針、RNase、DNase的配比依次為：2μg：20pmol：5U：2U。