[發明專利]適配體篩選方法及其應用

在審

• 申請號: 202110831036.4
• 申請日: 2021-07-22
• 公開（公告）號: CN113564155A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 李三暑;段安琪
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/115
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;秦彥蘇

本發明公開了適配體篩選方法及其應用。該方法可用于篩選與小分子結合的適配體。本發明的篩選方法可以解決目前SELEX技術所存在的實驗設計困難、篩選流程復雜等問題，更重要的是，運用此方法可以篩選得到的RNA適配體一方面是適體酶，另一方面又是人工核糖開關，可以應用于基因的5’或3’端，直接調控基因的表達。總而言之，本發明的方法可以用于產生與小分子結合的適配體，從而用于各類檢測、診斷輔助等，也可以作為人工核糖開關調控基因表達。

技術領域

本發明屬于分析檢測技術領域，具體涉及適配體及篩選方法。

背景技術

目前適配體主要是由一種名為“SELEX”的體外篩選技術而得到。傳統的SELEX技術是以合成的隨機DNA文庫開始的，其篩選過程十分繁瑣，耗時較長。隨后，各種新的SELEX技術隨之被開發出來，例如：對于大分子分離有效的硝酸纖維素膜過濾的SELEX、基因組SELEX(Genomic SELEX)、small RNA transcriptomic SELEX(smaRt-SELEX)、Capture-SELEX等，這些改良技術使SELEX的應用更為廣泛。但遺憾的是目前存在的SELEX技術仍然存在實驗設計困難、篩選流程復雜等問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供了適配體篩選方法及其應用。

本發明的目的一方面，是解決現有的SELEX技術存在的問題，提出一種全新的適配體篩選方法，將工具酶中不影響剪切位點的原始序列替換為隨機序列，使得工具酶結構被破壞不能發生剪切，由此構建文庫；加入目標分子后，目標分子與隨機序列結合并發生構象改變，使工具酶恢復完整結構并發生自我剪切；以工具酶發生剪切作為過濾篩選條件，進而通過若干輪篩選富集，得到可與目標分子結合的適配體。

一實施例中，所述工具酶包括核酶或DNA酶中的至少一種。

優選地，所述核酶包括錘頭狀核酶(Hammerhead Ribozyme，HHR)。

一實施例中，所述目標分子包括L-別異亮氨酸。

進一步地，在以錘頭狀核酶HHR為工具酶、以L-別異亮氨酸為目標分子的情況下，本發明實質提供了一種新的RNA適配體篩選方法，此篩選方法將核酶發生剪切作為過濾篩選條件，將Hammerhead Ribozyme(HHR)的莖Ⅱ全部替換成70個隨機堿基，此時核酶結構被打破不能發生剪切。通過將整個RNA文庫固定于鏈霉親和素磁珠(Beads)上，目標分子(L-別異亮氨酸)加入后，隨機序列發生折疊，幫助核酶恢復完整結構，核酶可以發生自我剪切。經過幾輪篩選富集得到與L-別異亮氨酸結合的適配體。

具體地，所述適配體篩選方法包括以下步驟：

步驟一，以錘頭狀核酶HHR的莖Ⅱ被隨機序列替代后的序列作為模板建立DNA文庫后，轉錄為所需要的RNA文庫；

步驟二，固定RNA文庫于磁珠上；

步驟三，加入目標分子并孵育，經過篩選富集得到與目標分子結合的適配體；

步驟四，測序得到適配體的序列。

更具體地，所述步驟一包括：

1)構建DNA文庫：取錘頭狀核酶HHR的莖Ⅱ被隨機序列替代后的序列SEQ ID No:01作為模板，以SEQ ID No:02為上游引物，以SEQ ID No:03為下游引物，以退火溫度59～61℃，循環數為4～6進行DNA文庫的構建；

2)轉錄為RNA文庫：取部分步驟1)得到的DNA文庫，在36～38℃轉錄反應1～3h得到RNA文庫。

更具體地，所述步驟二包括：