[發明專利]非洲豬瘟病毒CD2v截短蛋白及在制備野毒和自然弱毒檢測試劑盒中的應用

有效

• 申請號: 202110823057.1
• 申請日: 2021-07-21
• 公開（公告）號: CN113444153B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 金梅林;呂長杰;姜麗麗;趙亞;楊麗;趙麗;吳超;楊永;鄒忠;孫小美
• 申請（專利權）人: 華中農業大學;武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C12N15/34;C12N15/85;G01N33/569
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于生物技術領域，公開了非洲豬瘟病毒CD2v截短蛋白及在制備野毒和自然弱毒檢測試劑盒中的應用。通過比對發現原核表達的CD2v截短蛋白作為ELISA包被抗原不能檢測到非洲豬瘟病毒感染的陽性血清，而真核表達的CD2v蛋白作為ELISA包被抗原可以檢測非洲豬瘟病毒感染的陽性血清。以真核表達CD2v蛋白作為包被抗原制備的間接ELISA試劑盒，同時配合以非洲豬瘟病毒p54蛋白為包被抗原的間接ELISA試劑盒，可用于鑒別ASFV野毒株和自然弱毒株的感染，操作步驟簡單，結果可靠。因此，以本發明提供的真核表達的截短蛋白制備的非洲豬瘟病毒間接ELISA檢測試劑盒非常適合臨床大樣本的檢測，適合大規模推廣。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及非洲豬瘟病毒CD2v截短蛋白及在制備野毒和自然弱毒檢測試劑盒中的應用。

背景技術

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African SwineFeverVirus，ASFV)引起的豬的一種急性、烈性和高度接觸性的動物傳染病，其臨床癥狀主要表現為皮膚充血發紺、內臟器官嚴重出血、發病率高、死亡率高、病程短。世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定報告動物A類動物疫病，我國將此病規定為一類動物傳染病。2018年ASFV傳入我國，給我國養殖業造成巨大的經濟損失，隨著病毒的傳播，田間出現了突變弱毒株，該毒株潛伏期更長，造成的損失更為嚴重，因此檢測該毒株的存在對ASFV的防控顯得至關重要。

非洲豬瘟EP402R基因編碼CD2v蛋白，是一種重要的病毒糖基化蛋白，在病毒感染的細胞中，CD2v有三種表達形式，分別是89kDa的全長糖基化蛋白，及通過蛋白水解作用產生的大小為63kDa的N-末端糖基化片段和大小約為26kDa的C-末端非糖基化片段。非洲豬瘟病毒粒子通過該蛋白凝集豬的紅細胞，進而隨著血液的流動在全身組織器官中大量擴增傳播，在培養的原代細胞中，CD2v蛋白可以導致豬紅細胞形成玫瑰花環狀，這種玫瑰花環實驗也是判定ASFV滴度的一種實驗方法，因此該蛋白在病毒毒力方面發揮著重要作用。

國家非洲豬瘟專業實驗室對2020年6月至12月非洲豬瘟與流行病學進行了調查，成功分離到22株非洲豬瘟病毒，測序發現其中有11株病毒發生了突變或缺失，這些突變或缺失導致病毒CD2v蛋白翻譯提前終止，不能編碼出完整有功能的CD2v蛋白。CD2v是病毒吸附紅細胞活性(HAD)所必須的蛋白質，通過HAD實驗證實所有CD2v蛋白翻譯提前終止的突變株均喪失紅細胞吸附能力。田間非洲豬瘟CD2v突變或缺失弱毒株不能夠表達CD2v，失去了對豬紅細胞吸附的現象，導致病毒的毒力減弱。但值得注意的是，雖然CD2v突變或缺失自然弱毒株致病力較典型強毒株明顯降低，但仍然呈現明顯的殘留毒力，具有很強的水平傳播能力，會在田間豬群中廣泛傳播，造成持續性感染、慢性病毒程甚至死亡。非洲豬瘟CD2v缺失或突變自然弱毒株的逐漸流行，給ASFV的診斷帶來巨大障礙，為我國非洲豬瘟防控帶來全新挑戰。目前，主要基于實時熒光定量PCR的方法來檢測非洲豬瘟自然弱毒株和野毒株的感染，還沒有商品化針對非洲豬瘟CD2v突變或缺失自然弱毒株和野毒株的鑒別診斷ELISA試劑盒，然而由于自然弱毒株的毒力弱，有時表現出隱形感染或間歇性排毒，導致通過實時熒光定量PCR的方法在某些情況下存在漏檢等，從而不能及時發現，給疫病的控制帶來巨大的挑戰。非洲豬瘟病毒自然弱毒株侵入機體后會產生相應的抗體，因此通過ELISA實驗檢測豬只產生的抗體可以完美的避開檢測不到病毒核酸這一難題，及時發現豬群中是否存在自然弱毒株，盡早剔除，防止豬群大面積感染，將非洲豬瘟病毒防控的時間縮短，減少不必要的經濟損失。所以，以該蛋白作為包被抗原建立的ELISA檢測方法再配合以p54蛋白為包被抗原建立的ELISA檢測方法，可用于鑒別非洲豬瘟自然弱毒株和野毒株感染。