[發明專利]一種從頭合成黃烷酮的三功能酶及其合成方法和應用

有效

• 申請號: 202110817915.1
• 申請日: 2021-07-20
• 公開（公告）號: CN113528471B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 張新躍;何妍之;聶也森;張智萍;丁笠;陳磊;廖凱;趙晨宏
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N9/90;C12N9/10;C12N15/70;C12P17/06
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 杜春秋

1.一種從頭合成黃烷酮的三功能酶，其特征在于：所述三功能酶的氨基酸序列如SEQID?NO.5所示。

2.一種權利要求1所述從頭合成黃烷酮的三功能酶的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、從大豆中克隆4-香豆酰輔酶A連接酶基因4CL1和查爾酮異構酶基因CHI、從高粱中克隆查爾酮合酶基因CHS2至原核表達載體pET-32a-SUMO，構建重組質粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI；克隆4CL1基因時，設計一對PCR引物：正向引物為5’-GAACAGATTGGTGGTGGATCCATGGCACCTTCTCCACAA-3’；

反向引物為5’-CGACCCACCTCCGCCCGACCCACCTCCGCCACTAGTATTGGCCACCACCAAACC-3’；

克隆CHS2基因時，設計一對PCR引物：

正向引物為5’-GGCGGAGGTGGGTCGGCTAGCATGGCCGGCGCGACTGTG-3’；

反向引物為5’-ACTGCCCCCGCCACCCGATCCCCCGCCACCGGATCCGGCGGTGATGGCCGCTCCG-3’；

克隆CHI基因時，設計一對PCR引物：

正向引物為5’-GGTGGCGGGGGCAGTGAATTCATGGCAACGATCAGCGCG-3’；

反向引物為5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGACTATAATGCCGTGGC-3’；

步驟2、將重組質粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI轉化大腸桿菌表達株,經IPTG誘導、表達，純化得到重組酶蛋白。

3.?根據權利要求2所述一種從頭合成黃烷酮的三功能酶的合成方法，其特征在于，所述步驟2中，將重組質粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI轉化大腸桿菌表達株Rosetta(DE3),在16℃條件下由0.05?mM?IPTG誘導表達12h，離心收集大腸桿菌，采用細菌裂解緩沖液重懸菌體，經超聲破碎后，用鎳瓊脂糖凝膠純化重組蛋白。

4.一種權利要求1所述三功能酶在生物催化4-香豆酸合成黃烷酮中的應用，其特征在于，所述應用為體外酶促合成黃烷酮。