[發明專利]短鏈脫氫酶突變體及其用途

有效

• 申請號: 202110804329.3
• 申請日: 2018-04-24
• 公開（公告）號: CN113293151B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 游松;秦斌;秦鳳玉;張文鶴;劉亞林;祝天慧;郭繼陽;張飛霆
• 申請（專利權）人: 沈陽藥科大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽飛揚靈睿知識產權代理事務所(普通合伙) 21255
• 代理人: 靳玲

本發明涉及生物技術領域，涉及短鏈脫氫酶突變體及其用途，該類突變體是多種短鏈脫氫酶的野生型出發經過突變得到的，具體涉及短鏈脫氫酶突變體和其制備方法以及利用短鏈脫氫酶突變體通過催苯乙酮衍生化合物的還原，制備有光學活性的苯乙醇衍生物的方法。

本申請是沈陽藥科大學2018年04月24日申請的申請號為2018103711535，名稱為“短鏈脫氫酶突變體及其用途”的申請的分案申請。

技術領域：

本發明涉及生物技術領域，涉及短鏈脫氫酶突變體及其用途，該類突變體是多種短鏈脫氫酶的野生型出發經過突變得到的，具體涉及短鏈脫氫酶突變體和其制備方法以及利用短鏈脫氫酶突變體通過催化苯乙酮衍生化合物的還原，制備有光學活性的苯乙醇衍生物的方法。

背景技術

手性醇是眾多藥用活性成分的一種萬用合成砌塊，傳統的合成手性醇的方法有手性池法、不對稱合成法和拆分法等。上述三種方法都在商業化合成手性醇中有所應用，但它們卻有較多缺點：如使用大量昂貴的試劑、造成大量的污染、使用極端的操作條件等，這就需要開發一種更經濟的、環境友好的手性醇的合成方法。

在現在所有制備手性分子的技術中，生物催化是一種最有效且環境友好的方法(Nature2012,485,185-194)，因為生物催化能夠在溫和的條件及環境溫度下以極高的選擇性執行復雜的化學反應。正因如此，通過全細胞或者分離的酶生物催化合成手性醇便能夠克服上述的問題，其中利用酮還原酶(ketoreductases，縮寫為KREDs)或者醇脫氫酶制備手性醇便是可行方法之一(Chemical Reviews 2011,111,4088-4110.Chemical Reviews2011,111,4111-4140.)。

酮還原酶或羰基還原酶(EC 1.1.1.X)能夠選擇性的不對稱還原酮得到相應的手性醇，在還原過程中需要添加NADPH或者NADH作為輔因子。酮還原酶的底物為前手性的酮，類型比較廣泛，如α酮酯、β酮酯、脂肪鏈酮、環狀酮等。在手性藥物及其中間體的合成過程中，酮還原酶正在得到廣泛的應用，以調脂的他汀類藥物為例，其關鍵中間體3，5-二羥基酸的側鏈的合成需要非常苛刻的條件，而酮還原酶為其立體選擇性合成提供了多種更綠色的改進路線(Angewandte Chemie International Edition 2005,44,362-365.)。日本的Daicel和Kaneka公司分別建立了利用醇脫氫酶或羰基還原酶，同時利用葡萄糖或甲酸脫氫酶來循環酶的輔因子的合成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物還原系統。Kaneka公司利用重組的工程菌，可將300g/L的底物轉化為產物，轉化率可達96％，100％ee。Codexis公司利用醇脫氫酶/葡萄糖脫氫酶的生物還原系統建立了相似的路線，同時通過利用脫鹵素酶將氯原子替換為氰基來合成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(HN)。此過程由Lonza公司工業化生產，并提供給輝瑞公司用于合成阿托伐他汀鈣，此過程獲得了2006年的由美國環保署設立的美國總統綠色化學挑戰獎。BMS公司利用類似的酮還原酶，能夠將6-苯甲氧基-3,5-二酮基己酸甲酯雙還原直接產生有兩個手性中心的(3R,5S)-二醇的手性中間體。因此能夠將前體酮還原成手性醇的酮還原酶具有很大的應用前景；

而目前制約酮還原酶應用的主要問題就是天然的酮還原酶存在一定的缺陷，如活性低、選擇性差、選擇性與期望相反等，使其在生產實踐中的應用受到一定限制，成功修飾和改造酮還原酶使其具有更加良好的性質是一個研究的熱點。例如Codexis公司通過大量的突變及篩選，得到了能夠用于制備阿托伐他汀(Green Chemistry 2010,12,81-86.)、孟魯斯特(Organic Process ResearchDevelopment 2009,14(1),193-198.)、克唑替尼(Nature 2012,485,185-194)等手性藥物關鍵中間體的酮還原酶突變體。