[發明專利]高通量鑒定病原菌與宿主分子之間的相互作用的方法

在審

• 申請號: 202110801247.3
• 申請日: 2021-07-15
• 公開（公告）號: CN113584117A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 宋寧寧;李兆利;宋金妙;林紅;王書賢;王慧
• 申請（專利權）人: 濰坊醫學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;G01N33/569;G01N33/68;C12R1/32
• 代理公司: 深圳紫晴專利代理事務所(普通合伙) 44646
• 代理人: 郭清秀

本發明涉及病原菌鑒定技術領域，且公開了一種高通量鑒定病原菌與宿主分子之間的相互作用的方法，利用宿主細胞的模式識別受體和宿主免疫系統中的一些關鍵受體信號和傳導分子等基因，敲除宿主信息分子分離出巨噬細胞，使用含有報告基因質粒的病原菌感染經過基因組RNA干擾轉染的巨噬細胞，進一步利用基因敲除宿主信息分子獲得感染模型，檢測分析宿主感染病原菌后的存活變化及功能。通過研究病原菌蛋白和宿主蛋白相互作用網絡，非編碼RNA和蛋白相互作用，重點發現和研究新的病原菌因子和宿主因子，新的調控機制，確定侵入和存活缺陷突變株，高通量地分析菌體分泌蛋白在宿主細胞中的誘導表達。

技術領域

本發明涉及病原菌鑒定技術領域，具體為一種高通量鑒定病原菌與宿主分子之間的相互作用的方法。

背景技術

病原菌能產生致病物質，造成宿主感染，正常菌群與宿主處于生態平衡狀態，它們并不引起機體的感染，故屬于非病原菌范疇，在特定條件下，因為菌群失調、宿主免疫功能低下或菌群寄居部位改變造成了生態失調狀態，正常菌群也能引起感染，病原菌的感染性和致病力是病原菌－宿主免疫系統間相互作用的結果，現有的病原菌與宿主分子之間的相互作用的檢測方法的篩選效率低，同時容易產生操作誤差。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種高通量鑒定病原菌與宿主分子之間的相互作用的方法，具備高通量地分析菌體分泌蛋白在宿主細胞中的誘導表達地等優點，解決了檢測的篩選效率低，同時容易產生操作誤差的問題。

(二)技術方案

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種高通量鑒定病原菌與宿主分子之間的相互作用的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、通過利用宿主細胞的模式識別受體和宿主免疫系統中的一些關鍵受體信號和傳導分子等基因，敲除宿主信息分子分離出巨噬細胞；

S2、挑選S1中獲得的巨噬細胞感染病原菌，使用含有報告基因質粒的病原菌感染經過基因組RNA干擾轉染的巨噬細胞，選擇3-6個巨噬細胞表面細胞受體，通過RNA干擾或基因敲除后研究其病原菌在侵入和在細胞內存活的作用機制；

S3、進一步利用基因敲除宿主信息分子獲得感染模型，檢測分析宿主感染病原菌后的存活、細胞因子和免疫細胞亞群數量的變化及功能；

S4、將針對在宿主細胞內特異表達的靶蛋白的編碼基因采用敲除、互補等遺傳分析方法，構建相應的基因工程菌株，通過質粒轉染表達在相關的細胞模型和動物模型中，進一步鑒定和確認靶蛋白與病原菌的胞內生存是否相關；

S5、采用RNA干擾和抗體干擾等技術，闡明宿主細胞蛋白在病原菌感染中的應答及信號路調控機制，利用熒光標記、免疫組化以及細胞實時成像等技術，研究病原菌在細胞內所分泌蛋白的定向運輸和分布定位。

優選的，宿主細胞的模式識別受體為TLR4,TLR7和TLR9等，所述受體信號傳導分子為SHP-1，SHP-2,IL-17,MKP-5,β-arrestin1,β-arrestin2等。

優選的，S2中的檢測方法為RNA干擾，抗體封閉，Westernblot和酵母雙雜交等。

優選的，轉染后的巨噬細胞等待0.5h至6h后通過熒光掃描，報告基因分析或細菌培養和計數分析侵入巨噬細胞中的病原菌及在巨噬細胞中存活的病原菌數量。

優選的，病原菌為結核分枝桿菌H37Rv，宿主為實驗宿主。

(三)有益效果

與現有技術相比，本發明提供了一種高通量鑒定病原菌與宿主分子之間的相互作用的方法，具備以下有益效果：