[發明專利]一種小鼠全身組織灌流固定的方法

在審

• 申請號: 202110798503.8
• 申請日: 2021-07-15
• 公開（公告）號: CN113475499A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 劉志強;姚鑫;李媛媛;王振輝;邢秀玲;錢深
• 申請（專利權）人: 河南理工大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 鄭州丞企知識產權代理事務所(普通合伙) 41204
• 代理人: 李慧敏

本發明涉及腎臟免疫熒光染色技術領域技術領域，公開了一種有效改善觀察小鼠腎臟原纖毛免疫熒光的灌注固定方法，包括：小鼠腹腔麻醉后，迅速開胸暴露心臟，在左心尖部開口，將連接有蠕動泵的灌注針頭由開口插入左心室，在40?60ul/s的流速下行全身恒速灌流一定量的PBS清洗和一定量的10%中性福爾馬林固定，待小鼠全身僵硬，將小鼠腎臟取出，在10%中性福爾馬林溶液中固定一定時間，使可發現小鼠腎臟原纖毛經恒速灌流后數量分布極大提高，與傳統的簡易全身組織灌流固定相對比，有原纖毛的細胞比例由55%提高到90?98%，極大地提高了研究纖毛病變性疾病發病機制試驗的正確性。同時，本申請技術方案實驗操作重復性好，為后續研究纖毛病變性疾病發病機制打下良好的基礎。

技術領域

本發明涉及腎臟免疫熒光染色技術領域，特別涉及一種用于改善觀察小鼠腎臟原纖毛免疫熒光的小鼠全身組織灌流固定的方法。

背景技術

細胞原生纖毛是突出在細胞質膜的動態微管結構，它可以作為細胞感受器，適應胞外環境改變，維持細胞的正常生理功能。為了研究細胞原生纖毛病變性疾病發病機制，需要對其進行固定和染色，以便觀察細胞原生纖毛。在石蠟切片免疫組化實驗研究中，小鼠腎臟組織中的原纖毛分布及數量僅可通過免疫組織熒光染色觀察，在免疫組化實驗研究中，組織灌注固定效果對小鼠實驗結果至關重要，只有良好的組織灌注固定效果才能提高免疫組織熒染色質量，進而才能獲得良好的熒光染色效果，進而提高觀察腎臟原纖毛真實數量和分布。

傳統簡易的小鼠腎臟組織灌流技術，雖然適用于小鼠HE染色的形態觀察，但是一旦應用到免疫組化中，僅可觀察到小鼠部分原纖毛分布，很大程度上影響實驗結果的正確性。申請人通過不斷創新試驗研究，獲得了本申請的小鼠全身組織灌流固定技術。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種有效改善觀察小鼠腎臟原纖毛免疫熒光的灌注固定方法，可明顯改善原纖毛免疫熒光染色質量，具有原纖毛免疫熒光染色效果好、操作重復性好和應用價值高的特點，為后續研究纖毛病變性疾病發病機制打下良好的基礎。

為解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案來實現：

一種有效改善觀察小鼠腎臟原纖毛免疫熒光的灌注固定方法，包括：小鼠腹腔淺麻醉后，開胸暴露心臟并立即在左心尖部開口，將連接有蠕動泵的灌注針頭由開口插入左心室并止血固定，在40-60ul/s的流速下依次行全身恒速灌流一定量的磷酸鹽緩沖液PBS清洗和一定量的10%中性福爾馬林固定，待小鼠全身僵硬，將小鼠腎臟取出，在10%中性福爾馬林溶液中固定20-30h。

優選的：所述恒速灌流的環境溫度為15-30℃，所述全身恒速灌流的PBS和10%中性福爾馬林溫度為20-25℃。

小鼠腎臟取出后，在15-25℃的10%中性福爾馬林溶液中固定。

所述小鼠腹腔麻醉采用烏拉坦腹腔麻醉，不僅麻醉效果好，而且麻醉速度快。

所述左心尖部開口的大小為1.5-2.5mm，優選2mm，一方面有效保障液體灌輸量和灌輸效率，另一方面有效避免血液從開口漏出。

所述灌注針頭的直徑為0.8-1.5mm，優選1mm。一方面有效保障液體灌輸量和灌輸效率，另一方面有效避免血液循環系統破裂。

所述全身恒速灌流的流速優選50ul/s，當流速為50ul/s的時候，原纖毛免疫熒光染色效果最好，有原纖毛的細胞比例可達到98.2±0.8%。

所述蠕動泵優選采用Minipuls3蠕動泵。

本申請通過采用淺麻醉恒速灌流全身組織固定，在小鼠左心尖部開口，將連接有蠕動泵的灌注針頭由開口插入左心室，在40-60ul/s的流速下先后行全身恒速灌流一定量的PBS清洗和一定量的10%中性福爾馬林固定，并進一步結合將小鼠腎臟取出，在10%中性福爾馬林溶液中固定20-30h，使可發現小鼠腎臟原纖毛經恒速灌流后數量分布極大提高。