[發明專利]用于人RASSF1A基因甲基化檢測的特異性引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202110795567.2
• 申請日: 2021-07-14
• 公開（公告）號: CN113373204A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 張佳幸;劉梟男;崔亞麗
• 申請（專利權）人: 西安金磁納米生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 汪海艷

1.一種用于人RASSF1A基因甲基化檢測的特異性引物組，其特征在于：包括甲基化特異性引物對和未甲基化特異性引物對，對RASSF1A基因啟動子區域特定CpG位點進行識別與擴增；在甲基化特異性引物對和未甲基化特異性引物對中正向引物的5'端均標記地高辛，反向引物的5'端均標記生物素。

2.根據權利要求1所述的用于人RASSF1A基因甲基化檢測的特異性引物組，其特征在于：

所述甲基化特異性引物對中正向引物的核苷酸序列為：

5'-digoxin-GGGTTTTGCGAGAGCGC-3'；

所述甲基化特異性引物對中反向引物的核苷酸序列為：

5'-biotin-CGCTAACAAACGCGAACCG-3'；

所述未甲基化特異性引物對中正向引物的核苷酸序列為：5'-digoxin-GGGGGGTTTTGTGAGAGTGT-3'；

所述未甲基化特異性引物對中反向引物的核苷酸序列為：5'-biotin-CTTTAAACACTAACAAACACAAACCA-3'。

3.一種用于人RASSF1A基因甲基化檢測的試劑盒，其特征在于：包括人RASSF1A基因甲基化特異性擴增反應液和試紙條；人RASSF1A基因甲基化特異性擴增反應液包括甲基化特異性PCR反應組分、權利要求1或2所述的用于人RASSF1A基因甲基化檢測的特異性引物組。

4.根據權利要求3所述的用于人RASSF1A基因甲基化檢測的試劑盒，其特征在于：所述試紙條包括樣本墊、結合墊及檢測區；所述結合墊上噴涂地高辛單抗修飾的金磁微粒；所述檢測區包括檢測線和質控線，所述檢測線上噴涂鏈親和素，質控線上噴涂羊抗鼠IgG。

5.根據權利要求4所述的用于人RASSF1A基因甲基化檢測的試劑盒，其特征在于：所述地高辛單抗修飾的金磁微粒，為核殼結構的超順磁性復合微粒，其核為納米Fe₃O₄磁性粒子，表面是金殼層，金表面修飾有地高辛單抗。

6.一種用于人RASSF1A基因甲基化檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、提取并處理樣本基因組DNA；

提取樣本基因組DNA，并進行亞硫酸鹽處理，以用于PCR反應；

步驟2、針對待檢測基因設計特異性引物組；

針對待檢測RASSF1A基因的CpG位點，設計特異性引物組，所述特異性引物組為權利要求1或2所述的用于人RASSF1A基因甲基化檢測的特異性引物組；

步驟3、樣本甲基化狀態檢測；

步驟3.1、針對步驟1處理后的任一樣本，平行做兩管PCR反應，其中一管加入甲基化特異引物對，另一管中加入未甲基化特異引物對，兩管的PCR反應體系和反應條件相同并同時置于PCR儀中反應，獲得擴增產物；

步驟3.2、將兩管擴增產物分別滴加至權利要求4所述試劑盒中的試紙條樣本墊進行層析；根據檢測線顯示狀態，確定樣本甲基化狀態。

7.根據權利要求6所述的用于人RASSF1A基因甲基化檢測的方法，其特征在于，步驟3.2中根據檢測線顯示狀態，確定樣本甲基化狀態具體為：

當只有滴加含有甲基化特異引物對的擴增產物在試紙條的檢測線上顯色時，表示DNA甲基化狀態為完全甲基化；

當只有滴加含有未甲基化特異引物對的擴增產物在試紙條的檢測線上顯色時，表示DNA甲基化狀態為未甲基化；

當滴加含有甲基化特異引物對的擴增產物和含有未甲基化特異引物對的擴增產物均在試紙條的檢測線上顯色時，則表示DNA甲基化狀態為部分甲基化。

8.根據權利要求7所述的用于人RASSF1A基因甲基化檢測的方法，其特征在于，步驟1中所述樣本基因組DNA為組織基因組DNA、外周血游離DNA或尿液游離DNA。