[發(fā)明專利]一種高選擇性Xa因子抑制劑肝素七糖及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110794195.1
• 申請日: 2021-07-14
• 公開（公告）號: CN113666980A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉純慧;張桂姣;馬亞卿
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號: C07H19/02
• 分類號: C07H19/02;C07H1/00;A61P7/02;C12P19/18;C12P19/26;C08B37/10
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 張宏松

1.一種用來制備肝素七糖的二糖受體，結(jié)構(gòu)式如式I所示：

2.一種用來制備肝素七糖的二糖受體的甲苷衍生物，結(jié)構(gòu)式如式Ⅱ或式Ⅲ所示：

3.權(quán)利要求1所述的用來制備肝素七糖的二糖受體的制備方法，采用肝素酶III輔助化學(xué)酶法，包括步驟如下：

(1)以對硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)為起始原料、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)為糖基供體，在N-乙酰氨基葡糖基轉(zhuǎn)移酶(KfiA)酶促催化下進(jìn)行糖鏈延長，得到二糖骨架，然后以得到的二糖骨架為受體、UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)為糖基供體，在Heparosan合酶2(PmHS2)酶促催化下進(jìn)一步延長糖鏈，得到三糖骨架；

(2)將三糖骨架溶于氫氧化鋰水溶液，于冰上靜置至完全脫除GlcNTFA殘基的三氟乙酰基，所得產(chǎn)物于弱堿性、室溫下與對硝基氯甲酸芐酯(PNZ-Cl)混合反應(yīng)，使N-未取代的葡糖胺(GlcNH₃⁺)殘基的氨基保護(hù)，得到含N-對硝基芐氧羰基(PNZ)葡糖胺(GlcNPNZ)的三糖中間體；

(3)步驟(2)含GlcNPNZ的三糖于緩沖液中與肝素酶Ⅲ共同孵育，使GlcNPNZ與GlcA之間的糖苷鍵斷裂，得到二糖受體。

4.權(quán)利要求1所述的用來制備肝素七糖的二糖受體的甲苷衍生物的制備方法，

將權(quán)利要求3制備得到的二糖受體與乙酰氯、甲醇混合并加熱回流，經(jīng)NaOH處理后，純化得到二糖受體的α-或β-型甲苷衍生物。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述酶KfiA、PmHS2以大腸桿菌重組表達(dá)，N-乙酰氨基葡糖基轉(zhuǎn)移酶(KfiA)來源于大腸桿菌(E.coli)K5，Heparosan合酶2(PmHS2)來源于多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida)；

步驟(1)中，酶促催化在緩沖液中進(jìn)行，所用緩沖液為50mmol/L含5-8mmol/L MnCl₂的Tris-HCl，pH＝7.0～7.5，反應(yīng)溫度為20℃～37℃，反應(yīng)液均以C18柱層析純化；

步驟(1)中，起始原料用量為400-600mg的對硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)，糖基供體用量為1.2倍當(dāng)量的尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)，1.2倍當(dāng)量的UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)；

步驟(2)中，所述LiOH溶液的濃度0.5mol/L，優(yōu)選的，LiOH溶液的濃度為0.05mol/L～0.2mol/L；

步驟(2)中，對硝基氯甲酸芐酯(PNZ-Cl)的加入量為三糖的1.5倍量以上；

步驟(2)中，弱堿性pH為9-10；

步驟(3)中，肝素酶Ⅲ切割反應(yīng)緩沖液為含8-12mM CaCl₂的Tris-HCl緩沖液，pH＝7.0～7.5，濃度為50mmol/L，反應(yīng)溫度20℃～37℃。

6.一種高選擇性Xa因子抑制劑肝素七糖，含AT結(jié)合序列，具有如下如式Ⅴ結(jié)構(gòu)式：

其中，R₁為氫(-H)、甲基(-CH₃)或其他烷基；R₂為氫、乙酰基(-COCH₃)或磺酰基(-SO₃H)；R₃為磺酰基或乙酰基。