[發(fā)明專利]一種用于人腺病毒7型檢測的探針、試劑盒及其使用方法

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• 申請日: 2021-07-13
• 公開（公告）號: CN113355324A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設計）人: 曹現濤;陸亞平;魏光;李彬;李拼
• 申請（專利權）人: 國藥（武漢）醫(yī)學實驗室有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/6844
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 魏毅宏

本發(fā)明提供了一種用于人腺病毒7型檢測的探針、試劑盒及其使用方法。該試劑盒為基于MIRA熒光法的人腺病毒7型核酸檢測試劑盒。其中，MIRA的引物是根據腺病毒7型hexon基因特異序列設計的，本發(fā)明提供了一種快速、特異、靈敏、無需復雜儀器設備的核酸檢測試劑盒及其使用方法。

技術領域

本發(fā)明屬于分子診斷生物學技術領域，涉及一種用于人腺病毒7型檢測的探針、試劑盒及其使用方法。

背景技術

人腺病毒(human adenovirus，HAdV)是無包膜的雙鏈DNA病毒，根據感染性中和反應，HAdV可分為57個血清型，又根據核酸的同源性、纖維蛋白的特異性和抗原決定簇，目前鑒定的57個血清型又分為A～G 7個亞屬，A、F和G主要引起消化道感染、腹瀉，C、E和部分B亞屬主要引起呼吸道感染，其他B亞屬主要引起尿路感染，D亞屬只要引起角膜炎和結膜炎。并且由于其基因組的重組和變異，新的型別還在不斷地出現，某些型別可引起爆發(fā)流行。人感染HAdV可導致多種疾病，包括上呼吸道感染、支氣管炎、肺炎、結膜炎、急性出血性膀胱炎等。急性呼吸道感染患者陽性率為5.7％-6.36％。報道顯示HAdV感染人群主要集中3～6歲，中位年齡為4歲6月。5歲以下兒童占58.73％。學齡前兒童檢出率最高，其次是嬰幼兒和學齡兒童。傳播途徑主要是經空氣飛沫傳播。因此，準確鑒定和區(qū)分人腺病毒的血清型對于確定和優(yōu)化治療方案以及抑制病原菌的傳播具有重要意義。

傳統的檢測方法包括病毒分離鑒定、免疫熒光和普通PCR檢測法，存在成本高、耗時長，有假陽性等問題，不能及時為防疫部門提供病原學依據。為此我們根據人腺病毒7型六鄰體(hexon)基因高度保守區(qū)設計引物和MIRA探針，建立一種快速、特異、敏感的腺病毒檢測方法，對快速預警腺病毒爆發(fā)具有重要意義。

近年來，分子生物學方法不斷被應用到呼吸道病原體的快速檢測中，呼吸道病原體的實驗室診斷方法取得了很大的進展，核酸檢測已經成為了呼吸道病原體實驗室診斷的發(fā)展方向。相對于傳統的實驗室檢測法，分子診斷技術具有無可比擬的檢測速度、特異性和靈敏度，已成為實驗室診斷的新標準。

MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification)技術是一種多酶恒溫核酸快速擴增技術，基本原理是：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區(qū)域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結合到引物的3’末端，開始鏈的延伸，這個過程迅速高效地循環(huán)，從而完成目的片段超快速擴增。熒光檢測則依賴核酸外切酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用熒光監(jiān)測設備實現對目標片段擴增過程的實時監(jiān)控。MIRA技術具有快速、簡便、無需特殊儀器等優(yōu)點，目前已被應用于多種重要疾病病原體的檢測中。

針對現有技術中存在的問題，本發(fā)明研發(fā)并評估了多酶快速恒溫擴增熒光MIRA法作為人腺病毒7型核酸檢測的試劑盒。

發(fā)明內容

因此，本發(fā)明為了解決上述技術問題中的至少一個，提供了一種用于人腺病毒7型檢測的探針、試劑盒及其使用方法，該試劑盒能夠節(jié)約反應時間，反應溫度要求低。

根據本公開的第一方面，提供了一種引物組合，用于擴增包括腺病毒7型hexon基因序列的擴增片段，其特征在于，包括第一引物和第二引物，其中，

所述第一引物的序列為：

ATCATCACCACGCCGCCGCAGCAGAGGAGAAAG；

所述第二引物的序列為：

GTGTCTGTTGCACGGGCGAACTGCACCAGACCC。

在一些可能的實施方式中，還包括第三引物，所述第三引物的序列為：