[發明專利]分離胎兒滋養層細胞的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202110787392.0
• 申請日: 2021-07-13
• 公開（公告）號: CN113234163B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 何琪;毛愛平;蔣敏捷;陳蒙;徐至韻;張建光
• 申請（專利權）人: 北京貝瑞和康生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N5/073
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏

本發明涉及一種分離胎兒滋養層細胞的方法及試劑盒。具體地，本發明涉及用于分離純化胎兒滋養層細胞的抗體組合，包括用于負篩選的抗體和/或用于正篩選的抗體。本發明還涉及分離胎兒滋養層細胞的方法和試劑盒。其中所述方法包括以下步驟：（1）獲得包含滋養層細胞的母體組織樣本；（2）制備組織樣本單細胞懸液；（3）免疫磁珠法富集胎兒滋養層細胞；（4）細胞分選儀分選胎兒滋養層細胞。其中所述試劑盒包含以下試劑：（a）用于免疫磁珠法富集胎兒滋養層細胞的試劑；和/或（b）用于樣本清洗的試劑。

技術領域

本發明涉及一種利用免疫磁珠法富集與細胞分選儀分選相結合的細胞分離技術。具體地，本發明涉及一組用于分離純化胎兒滋養層細胞的抗體組合，包括用于負篩選的抗體和用于正篩選的抗體。本發明還涉及一種分離母體組織樣本中胎兒滋養層細胞的方法以及適用于該方法的試劑盒。

背景技術

在胚胎發育成桑椹胚并進一步發育過程中，開始出現分化沿透明帶內壁擴展和排列的一種個體較小的細胞，即為滋養層細胞。在內細胞團發育過程中，由滋養層細胞和胚外中胚層的壁層構成絨毛膜。隨著胚胎發育，叢密絨毛膜與基蛻膜共同構成了胎盤，而平滑絨毛膜則和包蛻膜一起逐漸與壁蛻膜融合。在此過程中，脫落的滋養層細胞即絨毛外滋養層細胞（Extravillous trophoblast, EVT）進入宮頸。

胎兒滋養層細胞可以作為一種胎兒遺傳物質的來源，用于進行無創產前診斷¹。因此純化出高純度的滋養層細胞，具有非常重要的臨床應用意義。

目前也有報道，從母體血液中可富集獲得滋養層細胞²；但母體血液中胎兒滋養層細胞的數量非常稀少，大約10⁸個母體細胞中含有1個胎兒滋養層細胞，從母體血液中分離胎兒滋養層細胞非常困難。

利用滋養層細胞的特異性表面抗體anti-HLAG染色的實驗表明，宮頸刮片樣本中滋養層細胞的比例大約是1/2000³。目前已報道的純化宮頸樣本滋養層細胞主要有顯微切割和微流控兩種技術^{4, 5, 6}。但兩種方法操作周期都非常長、成本昂貴并且對設備和實驗人員的操作技術要求都很高，而且技術和臨床應用可行性并沒有得到充分驗證。

利用細胞分選儀分選是一種常規且成熟的細胞分選技術，但由于大量背景細胞對特異性細胞染色的干擾，對于純度小于0.1%甚至1%的細胞分離仍然存在很大難度。即使在抗體非常特異的情況下，流式細胞儀分離純度也只能達到20%左右甚至更低⁷。由于宮頸刮片樣本中存在許多細胞碎片和宮頸本身存在細菌感染等因素，實際流式分選時滋養層細胞的純度可能遠小于1/2000。而宮頸刮片樣本中宮頸粘液的干擾，又給滋養層細胞的純化帶來更多難度。因此，在利用細胞分選儀分選前，對宮頸樣本等母體組織樣本中的滋養層細胞進行有效富集至關重要。

免疫磁珠法利用細胞表面特異性抗原和抗體結合，并利用磁力直接富集目標細胞（正篩選）或去除非目標細胞（負篩選）。正篩選一般可以達到幾倍到幾十倍的富集效果⁸，而負篩選一般可以達到幾倍到幾百倍的富集效果⁹。HLAG特異性在滋養層細胞上表達，可利用anti-HLAG進行滋養層細胞正篩選。而利用多種抗體進行正篩選會增加滋養層細胞的得率。目前尚無利用免疫磁珠負篩選法進行滋養層細胞富集的報道。

發明內容

本發明目的在于解決現有技術中，分離胎兒滋養層細胞操作復雜、周期長、成本昂貴、對實驗人員的技術要求高的問題。

首先，本發明涉及一種抗體組合，其包括：

A）第一抗體；或

B）第二抗體；或

C）第一抗體和第二抗體；其中，