[發(fā)明專利]一種通過麥胚無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)表達(dá)人成纖維細(xì)胞生長因子21的方法

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• 申請日: 2021-07-12
• 公開（公告）號: CN113336839A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李力;馬森;李正哲;李利民;韓小賢;鮑慶丹;王鳳成;王曉曦;孫冰華
• 申請（專利權(quán)）人: 河南工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K14/50
• 分類號: C07K14/50;C07K1/22;C12N15/82;C12N15/12
• 代理公司: 河南大象律師事務(wù)所 41129
• 代理人: 王映樸

1.一種通過麥胚無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)表達(dá)人成纖維細(xì)胞生長因子21的方法，其特征在于，包括：1）構(gòu)建以大腸桿菌pET28a為載體，包含F(xiàn)GF21基因的克隆質(zhì)粒，F(xiàn)GF21的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；2）通過mRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄得到mRNA模板；3）構(gòu)建麥胚無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)，將mRNA模板加入麥胚無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)中表達(dá)FGF21重組蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）中克隆質(zhì)粒的構(gòu)建方法為，將包含Seq ID No.1所示核苷酸序列的pET28a-FGF21質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中組成克隆載體，利用含卡那霉素的LB抗性培養(yǎng)基篩選出成功導(dǎo)入pET28a-FGF21質(zhì)粒的大腸桿菌克隆載體，增殖培養(yǎng)后提取質(zhì)粒獲得包含F(xiàn)GF21基因片段的克隆質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中部mRNA的體外轉(zhuǎn)錄方法為：以步驟1）中提取出的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大量包含T7啟動子-FGF21基因-T7終止子片段的線性DNA，以該線性DNA為模板通過T7 mRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行mRNA的體外轉(zhuǎn)錄操作，轉(zhuǎn)錄完成后對產(chǎn)物進(jìn)行DNase消化以純化mRNA，然后將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋100至300倍。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的引物如下：

正向引物：5’ - CACCATACCCACGCCGAAAC - 3’

反向引物：5’ - CGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGC - 3’

PCR擴(kuò)增程序采用先94 ℃預(yù)變性5 min，然后以94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72℃延伸1.5 min循環(huán)35次，最后以72 ℃延伸10 min完成擴(kuò)增。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3）為將20 μL模板mRNA、30 μL麥胚抽提液、747 μL翻譯緩沖液以及3 μL酶混合溶液混合均勻后構(gòu)成800 μL反應(yīng)體系，以37℃反應(yīng)24 h獲得FGF21重組蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，翻譯緩沖液包含： HEPES-KOH、乙酸鉀、2乙酸鎂、二硫蘇糖醇、磷酸肌酸、ATP、GTP、亞精胺和氨基酸混合溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，酶混合溶液包含1 μL肌酸激酶、1 μL蛋白酶抑制劑和1 μL核糖核酸酶抑制劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，F(xiàn)GF21重組蛋白使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。

9.一種麥胚抽提液的制備方法，其特征在于，所述方法為：浸泡小麥籽粒至萌動狀態(tài)，剝?nèi)⌒←溑哐?，洗去殘余胚乳并蘸干水分，加入液氮冷凍研磨小麥胚芽至粉末，向粉末中加入抽提緩沖液后超聲處理，以26000 g超速離心30 min，取上清液，其260 nm處吸光度值為0.2-0.25，將上清液冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述制備抽提緩沖液包括氯化鈣、二硫蘇糖醇、乙酸鉀、乙酸鎂、HEPES-KOH，調(diào)節(jié)pH至7.6。