[發明專利]以突變體細胞遷移功能評估基因變異致病性的方法及應用

有效

• 申請號: 202110779589.X
• 申請日: 2021-07-09
• 公開（公告）號: CN113528570B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 莫桂玲;薛容濤;徐進;孫明明;范喜杰;王瑩;呂美
• 申請（專利權）人: 廣州金域醫學檢驗中心有限公司;華南理工大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N15/62;C12N15/65;A01K67/027
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬

本發明涉及一種以突變體細胞遷移功能評估基因變異致病性的方法及應用，屬于動物模型構建技術領域。該方法包括以下步驟：構建中性粒細胞特異性表達人類ELMO1基因變異位點的表達體系：將攜帶待評估的基因變異位點序列的質粒克隆至ELMO1基因缺失斑馬魚突變體模型中，在中性粒細胞中特異性表達所述待評估的ELMO1基因變異位點；延時活體成像：通過延時活體成像，對所述斑馬魚基因缺失突變體模型中攜帶ELMO1基因變異位點的中性粒細胞進行可視化追蹤，評估該基因變異位點對中性粒細胞遷移功能的影響，從而評估該基因變異位點的致病性。采用該方法可基于動物模型來鑒定基因變異的功能變化，不依賴于病人的樣本，具有方便數據采集與保存，實驗重復性和準確性高的優勢。

技術領域

本發明涉及動物模型構建技術領域，特別是涉及一種以突變體細胞遷移功能評估基因變異致病性的方法及應用。

背景技術

由ELMO1基因翻譯得來的ELMO1蛋白，與DOCK2蛋白復合體相互作用，通過調節RAC蛋白的活性參與調控細胞運動功能。

在過去的十年中，隨著高通量基因組測序的出現，人類基因組信息已迅速積累。Dock2基因缺失已被報道與先天性免疫缺陷疾病相關，而與之相反，在世界各地的不同人群進行ELMO1的基因多態性的分析發現，ELMO1基因反而與糖尿病、炎癥性關節炎、腎臟疾病等自身免疫性疾病存在相關性。盡管ELMO1基因通過ELMO1-DOCK2-RAC1三元復合體行使調控細胞運動的功能，小鼠以及細胞系的研究都表明ELMO1基因突變導致細胞遷移功能受損，然而ELMO1基因缺失小鼠體內，中性粒細胞在慢性炎癥部位的堆積數量較野生型的明顯下降。這一中性粒細胞的趨化缺陷，反而導致了自身免疫性疾病的良好預后。而在沙門氏感染的炎癥性腸炎的研究中，ELMO1基因缺陷小鼠的巨噬細胞的細菌內化作用減弱，也導致了小鼠腸道內的細菌負擔的減少和腸道炎癥反應的發生，延緩了疾病進展。

以上小鼠模型中關于ELMO1基因的研究，結合對攜帶ELMO1基因突變的人群進行基因多態性分析發現，高表達水平的ELMO1蛋白能夠作為疾病進展的指標，預測了疾病較差預后。來自臨床樣本的生物信息學數據表明，ELMO1基因通過影響免疫細胞對于炎癥的趨化性，影響了疾病的進展。

然而，人群中存在的這些ELMO1基因突變是如何影響免疫細胞功能的，仍然需要更具體明確的功能驗證，來證實他們與疾病易感性之間的關系。在以往的實踐中，研究人員直接從患者全血細胞中分離出中性粒細胞，并對這些攜帶ELMO1突變的中性粒細胞進行了體外遷移能力測試，以鑒定其致病性。除了體外實驗，利用動物模型來進行基因突變體的體內功能驗證，是為臨床提供更可靠的疾病咨詢必不可少的策略。

綜上所述，目前對于特定基因變異位點是如何影響細胞運動的檢測鑒定，基于病人原始樣本的采集，這不利于大規模的變異位點的篩選，并且成本較高，重復性低，所需要的人力物力較大。因此，提出一種便捷準確的動物模型來進行特定基因變異位點的診斷學鑒定，迫在眉睫。斑馬魚作為一種與小鼠、人類都高度保守的脊椎動物，已經成功構建出了許多人類疾病模型，用于大規模藥物篩選。但目前利用斑馬魚模型來進行特定基因變異致病性的研究仍非常局限。研究大多數基于出血、心臟結構異常、電生理等易于檢測的指標開展，而這些手段在小鼠中也可以進行，斑馬魚作為模型的優勢并未完全體現。

發明內容

基于此，有必要針對上述問題，提供一種以突變體細胞遷移功能評估基因變異致病性的方法，采用該方法，可基于動物模型來鑒定基因變異位點的功能變化，不依賴于病人的樣本，具有方便數據采集與保存，實驗重復性和準確性高的優勢。

一種以突變體細胞遷移功能評估基因變異致病性的方法，包括以下步驟：

構建中性粒細胞特異性表達人類ELMO1基因變異位點的表達體系：將攜帶待評估的基因變異位點序列的質粒通過顯微注射的方法克隆至ELMO1基因缺失斑馬魚突變體模型中，在中性粒細胞特異性啟動子lyz的驅動下，在中性粒細胞中特異性表達所述待評估的ELMO1基因變異位點，從而得到斑馬魚基因變異位點表達體系；