[發明專利]一種檢測斑馬魚Acsl1a基因突變的方法

在審

• 申請號: 202110774837.1
• 申請日: 2021-07-08
• 公開（公告）號: CN113416787A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 劉思嘉;牛依萌;田菲;田得紅;王賀崐元;趙凱
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 張娟;肖柯岑

本發明提供了一種檢測斑馬魚ACSL1a基因突變的方法，包括提取斑馬魚基因組DNA，引物擴增、Hpy188I內切酶、瓊脂糖凝膠電泳分析步驟。本發明方法可以高效鑒別斑馬魚Acsl1a第7外顯子TCTGA基因序列是否缺失，通過酶切條帶的數量與片段大小分辨斑馬魚Acsl1a第7外顯子TCTGA基因為野生型、缺失突變體或是雜合型個體；本發明方法簡單、快速、對儀器設備的依賴度較低，極大地降低了鑒定成本，且能快速、準確地鑒定出雜合型樣本，具有極大的應用、推廣價值。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種檢測斑馬魚Acsl1a基因突變的方法。

背景技術

長鏈脂酰CoA合成酶1(long-chain acyl-CoA synthetase1，ACSL1)能夠催化長鏈脂肪酸生成相應的脂酰CoA，參與機體多種脂肪酸合成、代謝活動，是脂肪酸β氧化的關鍵酶。國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center,CZRC)設計并培育斑馬魚Acsl1a基因(Gene ID:555308)第7外顯子TCTGA序列缺失突變體品系，編號為ZKO332a。該品系斑馬魚第1號染色體Acsl1a基因第7外顯子TCTGA序列片段缺失，導致編碼區出現移碼突變，不能合成正確的ACSL1蛋白，生物學功能喪失。因此ZKO332a品系斑馬魚是研究動物及人類脂類代謝疾病理想的生物模型，是生物醫學、分子生物學、魚類學等學科常用的實驗對象。在眾多斑馬魚個體中，需要準確鑒別出Acsl1a基因第7外顯子TCTGA序列缺失突變體品系，以便進一步進行實驗研究。

目前最常用的鑒定基因片段序列插入、缺失的方法是Sanger測序或基于測序的熒光信號定量檢測技術，以上技術需要依賴昂貴的儀器設備和試劑，鑒定成本較高(200元/樣本，按照10元/反應，20個克隆子/樣本計算，不包含PCR擴增和基因克隆產生的費用)。另外，在檢測雜合型樣本時，需要對該樣本的兩套染色體(擬定是二倍體生物)的待檢測基因區段分別進行檢測，在具體的實驗方法上主要是對待檢基因片段的PCR擴增產物進行體外克隆，隨機選取若干克隆子進行測序，該方法成本高、操作復雜、試驗周期長，且出現假陰性的概率較高。

因此，提供一種能快速、高效且成本低的鑒別斑馬魚Acsl1a第7外顯子 TCTGA基因為野生型、缺失突變體或是雜合型個體的方法具有非常重要的意義和廣泛的應用前景。

發明內容

本發明提供了一種檢測斑馬魚Acsl1a基因突變的方法，包括如下步驟：

(1)提取斑馬魚基因組DNA；

(2)利用引物P1和引物P2對步驟(1)提取的DNA進行PCR擴增；所述引物P1為：5’-accgtggatggcttaagggtt-3’，引物P2為： 5’-gtgtcttgtggtttgctttgcca-3’；

(3)利用Hpy188I內切酶對步驟(2)的PCR擴增產物進行酶切；

(4)對步驟(3)的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，分析酶切條帶。

進一步地，上述檢測Acsl1a基因突變是檢測Acsl1a第7外顯子TCTGA 基因序列是否缺失；步驟(4)所述酶切條帶包含大小為471bp的條帶，則存在Acsl1a基因突變。

進一步地，步驟(1)所述提取方法為酚-氯仿抽提法、高鹽沉淀法、離心柱法、磁珠法；優選為酚-氯仿抽提法。

更進一步地，上述酚-氯仿抽提法包括如下步驟：將斑馬魚的尾鰭組織進行組織裂解和蛋白酶消化后，加入Tris平衡酚和氯仿混勻，離心，上清液加入異丙醇混勻后-20℃靜置，離心棄液后風干。

進一步地，步驟(2)所述PCR擴增反應體系為：滅菌的去離子水26.5 μL；Buffer3.5μL，dNTP 3.0μL，引物P1和引物P2各0.5μL，DNA 1μL， rTaq 0.1μL；