[發明專利]一種CRISPR/Cas9介導的植物多基因編輯載體的構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110773909.0
• 申請日: 2021-07-08
• 公開（公告）號: CN113564197A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 張輝;汪沖;羅鵬宇;洪政;張亞軍
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

1.一種CRISPR/Cas9介導的植物多基因編輯載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將多個sgRNA通過多順反子tRNA-gRNA方式連接到pMK-(1-12)中間載體上，每個中間載體上可以連接1個到多個sgRNAs，得到pMK(1-12)-PTG載體；

(2)將多個pMK(1-12)-PTG載體上的U6/U3表達盒連接到pMMK-Cas9載體上，pMMK-Cas9連接2個到7個pMK(1-12)-PTG載體上U6/U3表達盒，得到pMMK-PTG載體。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述pMK(1-12)是一套12個用于CRISPR/Cas9介導的基因編輯的中間載體，其中pMK1、pMK10、pMK11各含有一個OsU6表達盒，OsU6表達盒核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；pMK2、pMK3、pMK8、pMK9各含有一個OsU3表達盒，OsU3表達盒核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；pMK4、pMK5各含有一個OsU6a表達盒，OsU6a表達盒核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；pMK6、pMK7、pMK12各含有一個OsU6b表達盒，OsU6b核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)中，將多個sgRNA構建到pMK(1-12)中間載體上，首先根據基因打靶位點通過CRISPR-GE網站在線設計靶序列，合成引物，

gRNA[x]-F(SEQ ID NO.5)：

5‘-TAGGTCTCCN₉N₁₀N₁₁N₁₂N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆N₁₇N₁₈N₁₉N₂₀GTTTTAGAGCTAGA A-3’

gRNA[x]-R(SEQ ID NO.6)：

5’-CGGGTCTCAN₁₂N₁₁N₁₀N₉N₈N₇N₆N₅N₄N₃N₂N₁TGCACCAGCCGGG-3‘；

其中，N₁-N₂₀分別表示20bp靶序列的第1位至第20位上的核苷酸。