[發明專利]一種重組枯草芽孢桿菌及制備的轉氨酶和應用

在審

• 申請號: 202110772022.X
• 申請日: 2021-07-08
• 公開（公告）號: CN113583927A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 石利平;陳本順;葉金星;尹強;尹斌;徐春濤;程瑞華;孫偉振;江濤;汪浩;董玉茹;劉思琪
• 申請（專利權）人: 江蘇阿爾法藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/54;C12N15/75;C12N9/10;C12P17/18;C02F3/34;C12R1/125
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 馬曉敏

本發明涉及藥物合成及酶工程技術領域，尤其是一種重組枯草芽孢桿菌及制備的轉氨酶和應用，其中，將如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因連接到pHT43質粒的BamHI和ZraI位點，然后轉化到Bacillus subtilisATCC6633中進行表達，即得重組枯草芽孢桿菌。采用該重組枯草芽孢桿菌制得的轉氨酶用于合成西他列汀，由化合物II作為起始原料，在緩沖液、助溶劑、輔酶PLP、氨基供體的存在下，經轉氨酶催化轉化為西他列汀，其反應路線為，

技術領域

本發明涉及藥物合成及酶工程技術領域，具體領域為一種重組枯草芽孢桿菌及制備的轉氨酶。

背景技術

西他列汀(Sitagliptin)的化學名為(3R)-3-氨基-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氫-1,2,4-三唑并 [4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(結構式如下所示)。

磷酸西他列汀(sitagliptin phosphate)是一種新型抗II型糖尿病藥物，服用方式為口服，毎次一片，一次約100mg劑量，在2006年10月由默沙東公司成功研制并開發，經美國 FDA批準上市，是史上第一個用于治療II型糖尿病的二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制劑類藥物。

西他列汀的化學制備法與生物制備法均有報道，其中以ATA177轉氨酶用于制備西他列汀最為廣泛，國內外多所企業、高校對ATA117轉氨酶的優化進行了研究。如CN103608355A中，默沙東公司通過樹脂固載ATA117，對轉氨酶ATA117多次套用，降低了其生產成本。CN109777813A中，浙江工業大學通過將轉氨酶-PLP共固定化，進行西塔列汀的制備，該方法穩定性好，固載酶使用壽命長，有機溶劑耐受性好，可多次重復利用。

目前，關于轉氨酶的報道主要在酶活的提高、酶固定化等方面，對于酶催化造成的高COD廢水降解的研究鮮有報道。

而且，西他列汀的酶催化為最后一步反應，通過大腸桿菌制備的酶催化劑有細菌內毒素殘留，因此需要一種新的高效表達載體以及綠色無污染的表達細胞進行轉氨酶的制備。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組枯草芽孢桿菌及制備的轉氨酶和應用。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種重組枯草芽孢桿菌的制備方法：將如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因連接到pHT43質粒的BamHI和ZraI位點，然后轉化到Bacillus subtilisATCC6633中進行表達，即得重組枯草芽孢桿菌。

采用上述制備方法獲得的重組枯草芽孢桿菌。

采用上述重組枯草芽孢桿菌制得的轉氨酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明所述轉氨酶的制備方法為：將本發明的重組枯草芽孢桿菌，接種至LB液體培養基中，接種量為培養基體積的1～5％，37℃的條件下，220rpm搖床中過夜培養后，作為種子液；將新鮮的種子液接入TB培養基中發酵培養，37℃的條件下，220rpm搖床中培養至OD₆₀₀在0.6～0.8時向培養基中加入IPTG，IPTG的濃度為0.5mM，再于18℃誘導22h；發酵液誘導結束后，于4℃，12000rpm離心5min，分別收集菌體與上清液；將上清液加入飽和硫酸銨進行沉淀，4℃，12000rpm離心5min收集沉淀并凍干，獲得轉氨酶粗酶。

本發明所述的轉氨酶在合成西他列汀中的應用，其具體合成方法為：

由化合物II作為起始原料，在緩沖液、助溶劑、輔酶PLP(磷酸吡哆醛)、氨基供體的存在下，經轉氨酶催化轉化為化合物I，即西他列汀，其反應路線為，

所述助溶劑選自甲醇、乙醇、乙酸丁酯、DMSO中的任意一種，優選為DMSO；