[發(fā)明專利]一種產(chǎn)L-乳酸的重組菌及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110770111.0
• 申請日: 2021-07-07
• 公開（公告）號: CN113430127A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉龍;陳堅;呂雪芹;堵國成;李江華;劉延峰;劉甜甜
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P7/56;C12R1/865
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明公開了一種產(chǎn)L?乳酸的重組菌及其應(yīng)用，本發(fā)明的重組菌在釀酒酵母宿主中過表達了D?乳酸脫氫酶Dld1基因，并采用來源于凝結(jié)芽孢桿菌的乳酸脫氫酶LDH基因替換丙酮酸脫羧酶Pdc1基因和丙酮酸脫羧酶Pdc6基因，采用來源于可合成L?乳酸的乳酸乳球菌的L乳酸脫氫酶LLDH基因替換乙醇脫氫酶Adh1、甘油三磷酸脫氫酶1Gpd1或甘油三磷酸脫氫酶2Gpd2基因，敲除釀酒酵母中的轉(zhuǎn)化乳酸為丙酮的L?乳酸氧化還原酶基因Cyb2和羧基轉(zhuǎn)運蛋白Jen1基因。通過本發(fā)明的生物改造技術(shù)，最終實現(xiàn)L?LA的提升，搖瓶產(chǎn)量從最初的0.98g/L提升至29.55g/L，較原始耐酸菌株提高了30倍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種產(chǎn)L-乳酸的重組菌及其應(yīng)用，屬于定向代謝技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

乳酸因具有光學異構(gòu)特性，可以形成L-乳酸和D-乳酸。L-乳酸(L-LA，CH₃CHCOOH)是人和動物體內(nèi)正常的代謝物，是一種天然的有機酸；廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、煙草及化工領(lǐng)域。同時，L-乳酸還可用來生產(chǎn)生物降解塑料-聚乳酸(PLA)和綠色環(huán)保溶劑-L乳酸甲酯、L-乳酸乙酯等。PLA是一種性能優(yōu)異、價格合適的可降解材料。可降解塑料的需求量以年均復合增長33％的速率在增長，全球均處于發(fā)展早期，聚乳酸未來發(fā)展?jié)摿薮蟆Ｒ虼耍嵘齃-乳酸的生產(chǎn)能力及降低L-乳酸生產(chǎn)成本，對于促進全球可降解塑料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

L-乳酸的制備工藝主要有化學合成法、酶法轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。美國Monsanto公司首次開始利用化學合成法，使用乙醛與劇毒化合物氫氰酸在堿性催化劑作用下經(jīng)多步反應(yīng)合成乳酸。然而，該方法不但生產(chǎn)成本高、污染嚴重，而且安全性無法確定。乳酸酶法是以丙酮酸或2-氯丙酸為底物，經(jīng)過乳酸脫氫酶或L-2-鹵代酸脫鹵酶催化后獲得，專一性較高，但工藝要求嚴格且繁瑣，在工業(yè)上沒有廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵法，原料來源除了能利用葡萄糖、乳糖等單糖外，還能以淀粉、纖維素等多糖發(fā)酵；正以成本低廉、產(chǎn)物安全性高等優(yōu)點占據(jù)L-乳酸生產(chǎn)的重要位置。

在生產(chǎn)乳酸過程中，常常會面臨因產(chǎn)物累積而導致的酸脅迫問題。有機酸會導致發(fā)酵細胞生長減慢，從而影響發(fā)酵過程的產(chǎn)率。工業(yè)水平的乳酸生產(chǎn)需要添加大量的中和劑，如CaCO3、NaOH和NH₄OH。這限制了乳酸的生物生產(chǎn)，因為它損害了沉淀乳酸鹽的再生，并且涉及更高的成本。

目前，發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸常用的菌種為乳桿菌、米根霉、釀酒酵母等。乳桿菌具有較高的乳酸脫氫酶(LDH)活性，但發(fā)酵營養(yǎng)需求比較高、培養(yǎng)組分復雜、無法耐受低pH產(chǎn)物；米根霉營養(yǎng)要求低，但發(fā)酵過程中需要通氣攪拌，副產(chǎn)物積累比較嚴重，成本比較高；釀酒酵母具有清晰的遺傳背景。近年來，通過代謝工程手段將外源LDH引入釀酒酵母，輔以加強前體供給、途徑改造等策略，使其具備了異源生產(chǎn)L-乳酸的能力；同時，釀酒酵母具有可耐受低pH這一特殊優(yōu)勢，使其成為大規(guī)模生產(chǎn)有機酸的優(yōu)選菌株。

工業(yè)生產(chǎn)過程中，基于經(jīng)濟效益的考慮，生產(chǎn)商對有機酸產(chǎn)量要求較高，但在宿主細胞構(gòu)建過程中，隨著有機酸濃度的不斷積累形成了低pH環(huán)境，對宿主細胞的生長有很大程度的抑制。目前報道的微生物生產(chǎn)短鏈有機酸主要是添加中和劑(CaCO₃)來調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的低pH，生成的產(chǎn)物主要以有機酸鹽的形式存在，后續(xù)要先經(jīng)過酸解，才能進一步的分離、純化。一方面增加了產(chǎn)物分離、純化的成本和工序，另一方面如果前期添加的中和劑，或者后續(xù)酸解所用的酸反應(yīng)不完全，還會造成資源的浪費和環(huán)境的污染。

為解決上述存在的低pH抑制宿主細胞生長，添加中和劑提高成本、增加后續(xù)分離和純化工序、容易造成環(huán)境污染等問題。本實驗室前期以釀酒酵母CEN.PK2-1C為出發(fā)菌株，連續(xù)定向進化篩選得到可以耐受pH 2.44的突變體MTPfo-4(申請?zhí)枮?02010631510.4)。以MTPfo-4作為生產(chǎn)菌株可以提升菌種對于有機酸產(chǎn)物的耐受性，但是目前突變體MTPfo-4的L-乳酸的產(chǎn)量還不夠高，還不適用于工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容