[發明專利]一種鮮煙葉中同時分析黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的色譜分析方法

在審

• 申請號: 202110765575.2
• 申請日: 2021-07-07
• 公開（公告）號: CN113358797A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 蔡凱;高川川;許冬青;莫靜靜;雷波;張婕;趙會納;高維常
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/54;G01N30/74
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 張行超

1.一種鮮煙葉中同時分析黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的色譜分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、鮮煙葉中黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的提取：稱取冷凍干燥鮮煙葉粉末于微波提取罐中，加入內標，再加入提取液進行微波輔助提取，取提取物于離心管中離心，取上層清液過有機濾膜后得濾液；

B、鮮煙葉中黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的色譜分析：采用超高效液相色譜-紫外檢測器-串聯四級桿-飛行時間質譜進行色譜分析；

C、鮮煙葉中黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的定性與定量分析：定性采用高分辨質譜圖比對的方法，定量采用內標法。

2.根據權利要求1所述的一種鮮煙葉中同時分析黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的色譜分析方法，其特征在于：所述步驟A中提取液為0.1％甲酸的甲醇水溶液。

3.根據權利要求1所述的一種鮮煙葉中同時分析黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的色譜分析方法，其特征在于：所述步驟A中微波輔助提取的條件為800w，90℃提取5min。

4.根據權利要求1所述的一種鮮煙葉中同時分析黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的色譜分析方法，其特征在于：所述步驟A中內標為1.88mg/mL肉桂酸和14.796mg/mL己二酸。

5.根據權利要求1所述的一種鮮煙葉中同時分析黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的色譜分析方法，其特征在于：所述步驟B中色譜分析條件為Acquity UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm,)，柱溫35℃，進樣量為0.5μL；流動相A為超純水(含0.05％HCOOH)，B為質譜級乙腈，流速為0.35mL/min，梯度洗脫如下：初始98％A保持1min，16min變為60％A，20min變為5％A，保持到24min，25min變為0％A，保持到27min，29min變為98％A，保持到31min結束；質譜條件采用一級質譜ESI負模式，氮氣為霧化氣和錐孔氣，霧化氣與錐孔氣流速為800L/h和50L/h，霧化氣溫度450℃，源溫度120℃，毛細管電壓：2.0KV，錐孔電壓：35V，碰撞能力6eV，掃描時間為0.2s，間隔為0.02s，掃描范圍70-1000，檢測器電壓為1950V；利用亮氨酸腦咖肽為實時校準液，濃度為200ng/mL，流速為10μL/min，校正間隔為15s，且校正結果為3次平均；MS^e數據采集能量為6-35eV以獲得相應的碎片質譜圖。

6.根據權利要求1所述的一種鮮煙葉中同時分析黃酮、苯丙烷、香豆素及酚酰胺類次生代謝物的色譜分析方法，其特征在于：所述步驟C中定性采用高分辨準分子離子、碎片離子、紫外吸收結合數據庫Scripps、HMDB、Respect及Massbank對主要的代謝物組成進行鑒定，同時利用黃酮中不同糖苷鍵位置具有不同的MS^e碎裂規律，以確定黃酮的準確結構；定量采用內標法相對定量方法。