[發明專利]一種非洲豬瘟的重組腺病毒疫苗及其構建方法

有效

• 申請號: 202110763761.2
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113897395B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: 鐘鑫濤;陳平;張婷婷;李娜;王書芳;祝志剛;徐文才;鄭海權
• 申請（專利權）人: 嘉興安宇生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/34;C12N15/64;C12N15/55;A61K39/12;A61K39/39;A61P31/20
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧;曹小燕

1.一種非洲豬瘟病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗為通過構建一種非洲豬瘟病毒的四種抗原基因共表達的重組腺病毒載體，再經293TD37細胞包裝而獲得；

所述四種抗原基因分別為EP402R、EP153R、I177L和K205Rubiqutin，其中K205Rubiqutin是在K205R上添加分子佐劑ubiqutin獲得，EP402R和EP153R表達在E1區，I177L和K205Rubiqutin表達在E4區，構成四種抗原基因共表達的重組腺病毒載體pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin；

其中，所述重組腺病毒載體pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin需通過由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP構建的293TD37細胞實現重組腺病毒包裝，293TD37細胞的細胞株保藏編號為：CCTCC NO:C201996，保藏于中國典型培養物保藏中心；

其中，EP402R、EP153R、I177L、K205R、ubiqutin、pAd5LCL3分別具有如序列表中Seq IDNO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。

2.一種權利要求1所述的一種非洲豬瘟病毒的四種抗原基因共表達的重組腺病毒載體的構建方法，其特征在于，包含以下步驟：

1）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒環狀載體質粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位點，融合后的片段與載體無縫克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用無縫克隆方式連接，獲得缺失E1和E3基因的腺病毒載體質粒pAd5；

2）再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒環狀載體質粒pAd5的E4基因，使用PCR擴增并引入I-sceI酶切位點，再使用無縫克隆方法，獲得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒載體質粒pAd5△E4；

3）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒環狀載體質粒pAd5△E4的E2a基因，并將E4區的ORF6/7表達框放在敲除了E2a區的序列位置，再使用無縫克隆方法，獲得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒載體質粒pAd5LCL3；

4）構建腺病毒E1區域穿梭質粒pS5E1，通過DNA連接酶分別與EP402R、IRES、EP153R基因片段連接，構建非洲豬瘟腺病毒5型載體E1區域穿梭質粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R；

5）構建腺病毒E4區域穿梭質粒pS5E4-EGFP，I177L、2A、K205Rubiqutin基因通過融合PCR技術得到I177L-2A-K205Rubiqutin基因片段，通過對穿梭質粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP，并通過DNA連接酶與I177L-2A-K205Rubiqutin連接，構建非洲豬瘟腺病毒5型載體E4區域穿梭質粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin；

6）將穿梭質粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R與腺病毒載體質粒pAd5LCL3同源重組，得到腺病毒載體質粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R；

7）將穿梭質粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin與腺病毒載體質粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R同源重組，獲得四種抗原基因共表達的重組腺病毒載體pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin，pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin具有如序列表中Seq ID NO.7所示的核苷酸序列。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1）所述的腺病毒環狀載體質粒來源于在A549細胞中擴增野生型人腺病毒5型病毒，收集并濃縮病毒液，采用HirtVirual DNAExtract方法提取腺病毒5型基因組，使用cosmid方法將線性的腺病毒5型基因組構建成環狀的腺病毒環狀載體質粒。