[發明專利]一種精準定量的CUT＆Tag文庫制備方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202110761967.1
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113481607A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 李華;弓晉欣;俞振勛;胥政昊
• 申請（專利權）人: 蘇州京脈生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 江蘇昆成律師事務所 32281
• 代理人: 劉尚軻

1.一種精準定量的CUTTag文庫制備方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)提供兩種銜接子，第一銜接子為5`-S1-S2-S3-3`，第二銜接子為5`-S4-S5-S6-3`，所述S1為第一測序引物，S2為隨機標簽序列，S2的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S2的堿基的數量為1-95的任一整數，所述S3與S6的堿基序列相同、為Tn5轉座子固定序列，S4為第二測序引物，S5為隨機標簽序列，S5的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S5的堿基的數量為1-100的任一整數；將所述兩種銜接子與pA-Tn5酶進行孵育得到轉座復合體；

(b)再將轉座復合體與測試樣本進行孵育，得到擴增模板；

(c)將所述擴增模板進行PCR擴增，得到測序文庫。

2.如權利要求1所述的精準定量的CUTTag文庫制備方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述S1為5`-TGTGAGAAATCTAGCATACGACTTCGTC-3`,S3和S6的堿基序列為5`-AGATGTGTATAAGAGACAG-3`,S4為5`-CTGACTCCACACTGTAGAAGCCATGACACGG-3`，S2的堿基的數量為10-50的任一整數。

3.如權利要求2所述的精準定量的CUTTag文庫制備方法，其特征在于，兩種銜接子與pA-Tn5酶混合前，分別將單鏈的第一銜接子和第二銜接子與單鏈M進行退火雜交形成雙鏈銜接子，單鏈M的序列為5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3；將pA-Tn5酶與合成的雙鏈銜接子按照1：1的摩爾比進行混合，然后進行孵育，得到轉座復合體。

4.如權利要求1所述的精準定量的CUTTag文庫制備方法，其特征在于，在步驟(b)中，轉座復合體與測試樣本進行孵育，得到含“銜接子-核酸-銜接子”復合物的混合物，將該混合物進行純化，得到擴增模板；在步驟(c)中，將擴增模板用能夠特異性結合于第一銜接子的第一引物Primer1和特異性結合與第二銜接子的第二引物Primer2進行PCR反應，獲得擴增產物，將擴增產物進行純化，得到測序文庫。

5.如權利要求4所述的精準定量的CUTTag文庫制備方法，其特征在于，所述Primer1的結構為P1-I1-P2，其中P1為5`-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3`，I1為測序標簽序列，P2為5`-ACACTCTTTAGATCGTATGCTGAAGCAG-3`，所述Primer2的結構為P3-I2-P4，其中P3為5`-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3`，I2為測序標簽序列，P4為5`-GACTGAGGTGTGACATCTTCGGTACTGTGCC-3`。

6.如權利要求5所述的精準定量的CUTTag文庫制備方法，其特征在于，進一步的，所述I1選自：CTCTCTAT、TATCCTCT、AGAGTAGA、GTAAGGAG、ACTGCATA、AAGGAGTA、CTAAGCCT中的一種，所述I2選自：GCATGATC、TCCGTCTT、AGGACTCG、CCTGAGGA、ATCCGTAC、GAGAGATG、GTCTCTCC中的一種。

7.一種精準定量的CUTTag文庫制備試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：第一銜接子、第二銜接子、單鏈M和pA-Tn5酶，第一銜接子為5`-S1-S2-S3-3`，第二銜接子為5`-S4-S5-S6-3`，所述S1為第一測序引物，S2為隨機標簽序列，S2的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S2的堿基的數量為1-95的任一整數，所述S3與S6的堿基序列相同、為Tn5轉座子固定序列，S4為第二測序引物，S5為隨機標簽序列，S5的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S5的堿基的數量為1-100的任一整數，將第一銜接子和第二銜接子與單鏈M進行退火雜交形成雙鏈銜接子，將雙鏈銜接子與pA-Tn5酶混合及孵育得到轉座復合體，轉座復合體與測試樣本進行孵育得到擴增模板。