[發(fā)明專利]一種AKP異源表達(dá)工程菌及其構(gòu)建方法和高酶活性堿性磷酸酶的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110757108.5
• 申請(qǐng)日: 2021-07-05
• 公開（公告）號(hào): CN113583926B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹佳;董亞超;楊煥勝;何流琴;謝俊雁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/75;C12N9/16;C12R1/125
• 代理公司: 長(zhǎng)沙朕揚(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43213
• 代理人: 郭蓓霏;楊斌

1.一種AKP異源表達(dá)工程菌，其特征在于，以枯草芽孢桿菌（B.subtilis）為宿主，在該宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入攜帶有大腸桿菌（E.coli）phoA基因的重組質(zhì)粒后而獲得；所述大腸桿菌phoA基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1-3中任一項(xiàng)所示；

所述攜帶有大腸桿菌phoA基因的重組質(zhì)粒由大腸桿菌（E.coli）phoA基因插入穿梭載體后獲得，所述穿梭載體為pP43NMK載體；

所述重組質(zhì)粒中引入了mazE-mazF系統(tǒng)，所述mazE-mazF質(zhì)粒穩(wěn)定系統(tǒng)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示。

2.一種AKP異源表達(dá)工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）將大腸桿菌（E.coli）phoA基因插入穿梭載體，通過(guò)堿性裂解法制成攜帶有大腸桿菌phoA基因的重組質(zhì)粒；所述大腸桿菌phoA基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1-3中任一項(xiàng)所示；

（2）利用感受態(tài)轉(zhuǎn)化的方法將所述步驟（1）得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌（B.subtilis）中，得到AKP異源表達(dá)工程菌；

所述穿梭載體為pP43NMK載體，或由以下方法制備得到：將大腸桿菌DH5α用Km抗體篩選孵育，并通過(guò)堿裂解提取法和乙醇沉淀法制備pP43NMK質(zhì)粒的基因組DNA，使用Pst?I消化暴露出同源性，通過(guò)電泳跑膠回收線性載體，即得到所述的穿梭載體。

3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的制備方法具體包括如下步驟：采用引物對(duì)P43-PhoA-5/P43-PhoA-3對(duì)質(zhì)粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物和穿梭載體共電穿孔到L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的DH5α細(xì)胞過(guò)表達(dá)中，并直接克隆在BAD啟動(dòng)子控制下表達(dá)的ETgA操縱子，用卡那霉素選擇轉(zhuǎn)化體，采用堿性裂解法提取質(zhì)粒，并通過(guò)Ava?I/EcoR?I和BamH?I/Ava?I對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)一步篩選正確的限制性質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pP43NMK-PhoA-km；

所述引物對(duì)P43-PhoA-5/P43-PhoA-3的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5所示，所述質(zhì)粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

4.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的制備方法具體包括如下步驟：采用引物對(duì)P43-DelSig-5/P43-PhoA-3對(duì)質(zhì)粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物和穿梭載體共電穿孔到L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的DH5α細(xì)胞過(guò)表達(dá)中，在含有卡那霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)后選擇轉(zhuǎn)化子，采用堿性裂解法提取質(zhì)粒，并通過(guò)BsrG?I/Apal?I、BamH?I/Ava?I和EcoR?I/Pst?I對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步篩選正確的限制性質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pP43NMK-DelSigphoA-km；

所述引物對(duì)P43-DelSig-5/P43-PhoA-3的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.6、SEQ?IDNO.5所示，所述質(zhì)粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。