[發(fā)明專利]一種κ-卡拉膠酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110757041.5
• 申請日: 2021-07-05
• 公開（公告）號: CN113444709B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱艷冰;龍柳妃;倪輝;姜澤東;李利君;李志朋;鄭明靜;杜希萍;楊遠(yuǎn)帆
• 申請（專利權(quán)）人: 集美大學(xué)
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N15/56;C12N15/70
• 代理公司: 廈門創(chuàng)象知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35232
• 代理人: 王鳳玲;尤懷成

本發(fā)明提供了一種κ?卡拉膠酶突變體及其應(yīng)用，突變體是由如SEQ ID NO.1所示序列編碼的野生型κ?卡拉膠酶分別經(jīng)過其第42、51、155或198位氨基酸突變而產(chǎn)生的突變體。與野生型κ?卡拉膠酶相比，這些突變體的熱穩(wěn)定性得到了一定的提高，野生型酶(WT)在60℃熱處理40min后僅保留了3.90％的相對酶活力，而突變酶Q42V、I51H、K155A、G198S分別保留了29.23％、6.12％、18.50％、19.77％的相對酶活力。從而使κ?卡拉膠酶在卡拉膠寡糖工業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種κ-卡拉膠酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

卡拉膠是一種硫酸線性多糖，由β-D-半乳糖和α-D-半乳糖通過β-1,4糖苷鍵和α-1,3糖苷鍵交替連接形成的骨架結(jié)構(gòu)。根據(jù)1,4-連接殘留物中存在或不存在3,6-脫水-D-半乳糖，以及硫酸鹽基團(tuán)的數(shù)量和位置而不同，常見的商業(yè)化卡拉膠包括kappa(κ-)、lambda(λ-)、iota(ι-)三種，其二糖單元上分別含有1個、2個和3個硫酸基團(tuán)。κ-卡拉膠的降解產(chǎn)物κ-卡拉膠寡糖分子量和粘度降低，溶解性好，易吸收，并且具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抑制血管生成、抗氧化、抗病毒等多種有益生物活性，在藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。因此，卡拉膠的降解及降解效率的提高十分重要。

卡拉膠酶是糖苷水解酶，通過斷裂卡拉膠多糖鏈中的β-1,4糖苷鍵，形成低分子量的卡拉膠寡糖，κ-卡拉膠酶是指能夠特異性降解κ-卡拉膠的糖苷水解酶。由于卡拉膠在低于40℃的條件下會發(fā)生凝固，需要在較高的溫度下進(jìn)行降解，然而，目前大多數(shù)報(bào)道的κ-卡拉膠酶熱穩(wěn)定性較差，容易失活，限制了κ-卡拉膠酶在卡拉膠寡糖生產(chǎn)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出了一種κ-卡拉膠酶突變體，其具有較高的熱穩(wěn)定性和水解卡拉膠能力。

為此，在本發(fā)明的第一個方面中，提供了一種κ-卡拉膠酶突變體，其由如SEQ IDNO.1所示序列編碼的野生型κ-卡拉膠酶分別經(jīng)過其第42、51、155或198位氨基酸突變而產(chǎn)生的突變體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述突變體是將野生型κ-卡拉膠酶的第42、51、155或198位氨基酸進(jìn)行突變。與野生型κ-卡拉膠酶相比，這些突變體的熱穩(wěn)定性得到了一定的提高，野生型酶在60℃熱處理40min后僅保留了3.90％的相對酶活力，而突變酶Q42V、I51H、K155A、G198S分別保留了29.23％、6.12％、18.50％、19.77％的相對酶活力，從而使κ-卡拉膠酶在卡拉膠寡糖工業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

可選地，所述野生型κ-卡拉膠酶的第42位氨基酸由Gln變?yōu)閂al，第51位氨基酸由Ile變?yōu)镠is，第155位氨基酸由Lys變?yōu)锳la，第198位氨基酸由Gly變?yōu)镾er。

可選地，所述突變方式為定點(diǎn)突變。

在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種編碼上述κ-卡拉膠酶突變體的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5所示。

在本發(fā)明的第三個方面中，提供了一種構(gòu)建體，其包含編碼上述κ-卡拉膠酶突變體的基因。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

圖1為野生型和突變型κ-卡拉膠酶的SDS-PAGE分析；

圖2為野生型和突變型κ-卡拉膠酶的熱穩(wěn)定性；

圖3為野生型和突變型κ-卡拉膠酶水解κ-卡拉膠的能力。

具體實(shí)施方式