[發明專利]一種CSN1S1基因敲除載體及CSN1S1基因敲除乳腺上皮細胞的制備方法

在審

• 申請號: 202110755642.2
• 申請日: 2021-07-05
• 公開（公告）號: CN113355356A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 安小鵬;侯金星;宋宇軒;李廣;張磊;曹斌云;胡建宏;何勇龍
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N5/10
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 李博

本發明提供了一種CSN1S1基因敲除載體以及CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮細胞的制備方法，涉及基因工程技術領域，所述基因敲除載體包括CRISPR/Cas9載體骨架與連接在所述載體質粒上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。本發明通過該基因敲除載體簡便、快速、高效地敲除了奶山羊CSN1S1基因，獲得了純合的敲除CSN1S1基因的奶山羊乳腺上皮細胞。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種CSN1S1基因敲除載體及CSN1S1基因敲除乳腺上皮細胞的制備方法。

背景技術

CRISPR/Cas系統最早可追溯至1987年，科學家發現在大腸桿菌堿性磷酸酶基因附近存在重復序列，用于對抗病毒的入侵和外源DNA。根據Cas蛋白的不同分為三種主要類型，分別為I型、II型和III型，而CRISPR/Cas9是基于II型CRISPR系統開發而來的，主要由RNA導向的Cas9核酸內切酶、一條導向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)組成。在這一系統中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA結合形成雙鏈RNA，引導Cas9蛋白至靶序列上，Cas9蛋白的兩個功能域可以發揮內切酶的切割作用，即HNH和RuvC結構域，分別切割基因組上與crRNA的互補鏈和非互補鏈，造成DNA的雙鏈斷裂(doublestrandbreak,DSB)，從而啟動細胞內的DNA損傷修復機制，導致修復后發生插入/缺失(indel)，達到移碼突變的效果，最終實現基因敲除的目的，目前該技術已經成熟的運用于原核及真核生物的基因組編輯中。

乳中的蛋白質主要由酪蛋白組成，如羊乳中的酪蛋白含量則達到了總蛋白質的90％以上，酪蛋白包含αs1-酪蛋白(Csn1s1)，β-酪蛋白(Csn2)，αs2-酪蛋白(Csn1s2)以及κ酪蛋白(Csn3)。αs1-酪蛋白是一類單鏈多肽，包含199個氨基酸殘基，在山羊乳中的含量為5.6％，而在母乳中卻不含有的αs1-酪蛋白。αs1-酪蛋白是一種容易引起人類過敏的蛋白，易誘發嬰幼兒濕疹、腹痛、腹瀉等過敏反應，更易危及嬰幼兒的生命。編碼酪蛋白的基因普遍具有多態性，CSN1S1基因的多態性不僅會影響羊乳中酪蛋白的含量，還會影響羊乳的營養特性和工藝特性，同時有研究表明CSN1S1基因中11bp的indel突變與關中奶山羊乳中的酸度有顯著影響。

目前，對CSN1S1基因的研究主要集中在與泌乳及乳成分相關性狀的研究上，有效的構建一種CSN1S1基因敲除乳腺上皮細胞系對于探究CSN1S1調節奶山羊乳蛋白代謝的分子機制和構建精準而快速的改善奶山羊乳品質的方法至關重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種CSN1S1基因敲除載體，所述基因敲除載體能高效、快速、簡便地敲除CSN1S1基因。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種CSN1S1基因敲除載體，所述基因敲除載體包括CRISPR/Cas9載體骨架與連接在所述載體質粒上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。

優選地，所述CRISPR/Cas9載體骨架為PX458。

優選地，所述的DNA片段為特異性靶向奶山羊CSN1S1基因的sgRNA。

本發明還提供了一種上述基因敲除載體的構建方法，包括以下步驟：

(1)根據奶山羊CSN1S1基因第一個外顯子序列設計打靶位點，所述第一個外顯子序列如SEQ ID NO:1所示，所述打靶位點的靶序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)根據SEQ ID NO:2所示核苷酸序列設計正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

(3)將所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列進行退火反應形成雙鏈DNA；