[發明專利]一種基于酵母細胞表面展示技術的爆炸物可視化生物傳感器及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110755123.6
• 申請日: 2021-07-05
• 公開（公告）號: CN113481114B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 楊建明;梁波;劉云慧;湯若昊;王兆寶;李美潔
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12Q1/02;C12Q1/25;C12R1/865
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發明提供了一種基于酵母細胞表面展示技術的爆炸物可視化生物傳感器及其制備方法和應用。所述爆炸物可視化生物傳感器中含有錨定蛋白的編碼基因和爆炸物可視化的目標基因dntA或dntB基因。本發明利用錨定蛋白將目標基因表達產物錨定到宿主菌表面，最終獲得爆炸物可視化生物傳感器。該生物傳感器能夠特異性的將2,4?二硝基甲苯（2,4?DNT）降解成一種肉眼可見的紅色物質2?羥基?5?甲基苯醌，進而判斷待測樣品中是否存在爆炸物分子，并且其在420nm處具有最大吸光值，可根據標準曲線計算2,4?DNT濃度，其穩定性很好，且檢測范圍寬、靈敏度高、方法簡便、成本低、安全性強，因此具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說是一種基于酵母細胞表面展示技術的爆炸物可視化生物傳感器及其制備方法和應用。

背景技術

微生物細胞表面展示技術是利用錨定蛋白的作用將目標肽或蛋白質在展示在噬菌體、細菌和酵母細胞的表面。與從細胞質中純化肽或蛋白質酶，微生物細胞表面展示有三個優勢。首先，目標蛋白可以在錨蛋白的作用下錨定在宿主細胞的外膜上，因此展示的蛋白能夠直接接觸細胞外界環境種的底物，從而加快蛋白與底物的反應。其次，通過使用細胞膜作為基質，蛋白質的穩定性提高。第三，只需收獲細胞即可獲得蛋白質，無需冗長繁瑣的純化過程。到目前為止，該方法已廣泛應用于疫苗篩選、環境修復、全細胞催化、生物傳感器等領域。在生物傳感器方面，已經開發了各種檢測模式和系統，具有優異的靈敏度、特異性和穩定性，包括基于細菌或酵母表面展示系統的電化學和光譜學檢測中。

生物傳感技術是利用基因工程手段對菌株進行改造，使得該微生物在感應特定化合物或者特定化合物在微生物中的代謝產物后，微生物發生可以被檢測的變化，從而達到對特定化合物進行檢測的目的。這種生物傳感器主要由感應元件和報告元件兩部分構成，其中感應元件可特異性地感應靶標化合物，感應元件是負責基因轉錄的啟動子、核糖體結合位點、終止子、轉錄調控因子等等；而報告元件可在感應元件的作用下而產生感應信號，一般常用的報告元件包括綠色熒光蛋白（GFP）、黃色熒光蛋白（YFP）、紅色熒光蛋白（RFP）和熒光素酶，分別產生綠色熒光、黃色熒光、紅色熒光和自發光等可以被檢測的感應信號。這些較為常見的報告元件的特點是技術成熟、容易操作，但是熒光和自發光的檢測需要借助于分析儀器，例如酶標儀、紫外分析儀、熒光檢測儀、自發光檢測儀等，還需要對熒光信號和自發光信號進行定量和定性分析。熒光和自發光均不能實現肉眼觀察，尤其是在由外界光照的情況下。

戰區殘留爆炸物（例如地雷）對于生命安全、生態系統都造成了不可修復的損傷，因此針對地雷進行安全有效的檢測具有重要的戰略意義。通過生物傳感技術對殘留地雷進行檢測是一種有效的手段。爆炸物（例如地雷）的有效成份為為2,4,6-三硝基甲苯（TNT），TNT可自然分解為多種化合物，如1,3-二硝基苯（1,3-DNB）和2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT），其中2,4-DNT的穩定性最高，可在自然環境中長期存在。以色列科學家Shimshon Belkin報道了對爆炸物分子2,4-DNT的感應元件，即yqjF啟動子，利用GFP作為報告元件，構建了檢測2,4-DNT的生物感應系統，檢測限達到0.01 mg/L（New Biotechnology, 2020, 59, 65-73），處于國際上領先水平。此生物感應系統需使用儀器進行特定波長的紫外激發，以及綠色熒光信號的收集。另外，多種非GFP物質都能在紫外激發下發出綠色熒光，從而產生干擾信號。因此，該傳感器的特異性較差，大大限制了其在復雜環境中的應用。

但到目前為止，國內外無利用表面展示來進行爆炸物分子可視化檢測的相關報道。

發明內容

為了實現爆炸物分子的可視化檢測，本發明提供了一種一種基于酵母細胞表面展示技術的爆炸物可視化生物傳感器及其制備方法和應用。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：