[發(fā)明專(zhuān)利]一種快速檢測(cè)糧食中百菌清殘留的試紙條的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110754964.5
• 申請(qǐng)日: 2021-07-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113624729A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王中江;郭增旺;赫志強(qiáng);韓麗杰;王卓
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 黑龍江譜尼測(cè)試科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/64
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/64;G01N30/02;G01N30/72;G01N33/53;G01N33/533;G01N33/558;G01N33/577;G01N33/58
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1.一種快速檢測(cè)糧食中百菌清殘留的試紙條的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)熒光探針的制備：采用銪納米材料與單抗偶聯(lián)制備熒光探針，取800μL 0.2moL/L的硼酸緩沖液于2mL的離心管中，加入200μL聚苯乙烯熒光微球乳膠，渦旋混勻；將離心管置于數(shù)控高功率超聲儀中超聲12-18min，以使乳膠材料在溶液中均勻分散；加入40μL 15mg/mL的EDC水溶液，室溫下渦旋振蕩10-20min；然后14000r/min，10℃條件下高速離心10min，棄上清以去除過(guò)量的EDC，沉淀物用1mL硼酸緩沖液復(fù)溶，重復(fù)超聲步驟；加入一定量的抗體水溶液渦旋混勻，并轉(zhuǎn)移至搖床振蕩器上室溫振蕩12h，使抗體與微球材料充分偶聯(lián)；重復(fù)離心步驟，棄上清以去除未偶聯(lián)的抗體，下層沉淀用1mL含0.5％BSA的硼酸緩沖液復(fù)溶，再次重復(fù)超聲步驟使其均勻分散；隨后轉(zhuǎn)移至搖床振蕩器上室溫振蕩2-5h，以封閉微球材料表面的未結(jié)合位點(diǎn)；待反應(yīng)完成后，將制得的探針于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條的檢測(cè)條件篩選：偶聯(lián)銪的單抗標(biāo)記濃度(抗CTN-單克隆抗體50-100μg/mL)、熒光探針用量(進(jìn)行50、100、200、300、400和500倍的稀釋使用)、檢測(cè)線上檢測(cè)抗原濃度(CTA-BSA 2-5mg/mL)、檢測(cè)線抗原噴涂速率(0.4～0.8μL/cm)。

(3)時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條的制備：在NC膜上噴涂抗原CTA-BSA作為T(mén)檢測(cè)線，羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線(C線)，包被后置于37℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘2h，將樣品墊、吸水紙、NC膜與PVC底板進(jìn)行組裝，切成寬3mm的試紙條后避光干燥備用。

(4)樣品的檢測(cè)：①樣品前處理：糧食粉碎過(guò)20目篩，分裝避光保存；②提取時(shí)間的篩選：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g糧食樣品，分別加入5mL提取劑70％甲醇水，充分振蕩3-10min，室溫離心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用樣品緩沖液稀釋4倍，制得待測(cè)樣品液；③樣品提取液稀釋比例的選擇(樣品提取液與反應(yīng)緩釋液的稀釋比例設(shè)置為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5)；④檢測(cè)分析：取100μL樣品緩沖液或待測(cè)樣品液，加入含有熒光探針的微孔中吹打混勻，37℃孵育2-5min；將試紙條插入微孔，37℃反應(yīng)5-10min，隨后對(duì)熒光層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)分析。定性分析：在紫外燈下通過(guò)肉眼判斷定性結(jié)果，當(dāng)含有一定濃度待測(cè)物時(shí)，T線不顯線，C線顯紅色熒光，則結(jié)果為陽(yáng)性；相反，當(dāng)無(wú)待測(cè)物時(shí)T線和C線均顯紅色熒光，結(jié)果為陰性。定量分析：反應(yīng)結(jié)束后30s內(nèi)，將熒光層析試紙條插入熒光讀數(shù)儀讀取結(jié)果，得到被測(cè)糧食中百菌清的含量。

(5)準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)：對(duì)含有50μg/kg百菌清的空白糧食樣品分別采用該時(shí)間分辨熒光免疫層析定量分析法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)測(cè)定兩種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)糧食中百菌清殘留的試紙條的制備方法，其特征在于：步驟(1)采用銪納米材料與單抗偶聯(lián)制備熒光探針的方法為：取800μL 0.2moL/L的硼酸緩沖液于2mL的離心管中，加入200μL聚苯乙烯熒光微球乳膠，渦旋混勻；將離心管置于數(shù)控高功率超聲儀中超聲12-18min，以使乳膠材料在溶液中均勻分散；加入40μL 15mg/mL的EDC水溶液，室溫下渦旋振蕩10-20min；然后14000r/min，10℃條件下高速離心10min，棄上清以去除過(guò)量的EDC，沉淀物用1mL硼酸緩沖液復(fù)溶，重復(fù)超聲步驟；加入一定量的抗體水溶液渦旋混勻，并轉(zhuǎn)移至搖床振蕩器上室溫振蕩12h，使抗體與微球材料充分偶聯(lián)；重復(fù)離心步驟，棄上清以去除未偶聯(lián)的抗體，下層沉淀用1mL含0.5％BSA的硼酸緩沖液復(fù)溶，再次重復(fù)超聲步驟使其均勻分散；隨后轉(zhuǎn)移至搖床振蕩器上室溫振蕩2-5h，以封閉微球材料表面的未結(jié)合位點(diǎn)；待反應(yīng)完成后，將制得的探針于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)糧食中百菌清殘留的試紙條的制備方法，其特征在于：步驟(1)熒光探針的制備方法中熒光微球乳膠溶液的超聲時(shí)間為12-18min，熒光微球的震蕩活化時(shí)間為10-20min，加入抗體后的震蕩反應(yīng)時(shí)間為2-5h。