[發明專利]一種表達貓ω干擾素的基因工程菌的生產工藝

在審

• 申請號: 202110751063.0
• 申請日: 2021-07-02
• 公開（公告）號: CN113322222A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 廖洪;武慧芳
• 申請（專利權）人: 江蘇恒豐強生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/20;C12N15/70;C07K14/555;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州欣達共創專利代理事務所(普通合伙) 32405
• 代理人: 崔原

1.一種表達貓ω干擾素的基因工程菌的生產工藝，其特征在于，包括以下步驟：貓干擾素工程菌的構建和重組大腸桿菌誘導表達生產工藝，所述重組大腸桿菌誘導表達生產工藝依次包括發酵、上罐發酵、離心與破碎、包涵體洗滌、變性、純化、復性和過濾除菌，具體步驟如下；

S1、貓干擾素工程菌的構建：登錄GenBank，查找編碼貓ω干擾素成熟蛋白的基因序列(序列號為：NM_001102440.1)利用SignalP 3.0Server軟件預測此基因可能含有一段信號肽序列，為其氨基酸序列的前23個氨基酸，利用TargetP 1.1server軟件檢測此序列功能，發現其為幫助蛋白分泌的信號肽而非蛋白結構所必需，因此去掉信號肽序列，剩下編碼成熟貓ω干擾素的基因序列，其核苷酸長度為543bp；將貓ω干擾素的編碼密碼子與大腸桿菌偏好性密碼子進行比對，根據密碼子的兼并性，在不改變氨基酸組成和排列的基礎上，對已知的編碼貓ω干擾素的基因序列進行改造，替換為大腸桿菌偏好的密碼子，然后將替后的基因序列5’、3’端分別加上NdeI、XhoI酶切位點進行全基因合成，并連接入原核表達質粒pET28a中，得到重組原核表達質粒pET28a-FeIFN-ω；將重組質粒轉入大腸桿菌BL21中，構建篩選出貓干擾素工程菌；

S2、重組大腸桿菌誘導表達生產工藝：

2.1、發酵：取1mL帶有重組質粒甘油管接種于200mL含50μg/ml卡那霉素的LB培養液(胰蛋白胨10％，酵母浸出粉5％，氯化鈉10％)中，37℃培養200r/min培養12-18小時，制備一級種子；一級種子液以4％的接種量接種于600mL含卡那霉素的LB培養液，共接兩瓶，37℃培養200r/min培養4h，制備二級種子；

2.2、上罐發酵：在發酵罐內裝入培養基和消泡劑后，滅菌后按照培養基體積的5％接種二級種子液，37℃通氣培養，在培養至OD₆₀₀值為4.0-6.0時加入終濃度為0.3mM的IPTG進行誘導表達，再繼續培養5-6h，pH控制在6.5左右，溶氧控制在30％以上，當溶液迅速上升時，流加補料；

2.3、離心與破碎：培養結束后，離心收集菌體，對濕重菌體進行稱重，按1:20(w/v)比例用溶液I(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/L EDTA)重懸菌體，高壓均質機在800～1000bar破碎3～5次，將破碎菌體4℃以8000r/min離心30min，所得沉淀即為包涵體；

2.4、包涵體洗滌：將包涵體分別用溶液II(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/LEDTA、1％TritonX-100)、溶液III(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/L EDTA、2.0mol/L尿素)各洗滌一次，4℃以8000r/min離心20分鐘收集沉淀，即為初步純化的干擾素包涵體：

2.5、變性：按1:40(w/v)比例加入變性液充分溶解包涵體，2～8℃攪拌48小時，使包涵體完全溶解，4℃以8000r/min離心10分鐘收集上清，再0.22μm過濾，即為包涵體的變性溶液；

2.6、純化：按照蛋白純化儀的操作說明進行操作，采用Chelating Sepharose^TMFastFlow親和層析填料預裝柱，用PBS清洗至基線平穩，再用結合緩沖液(pH值8.0，500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris·Cl、100mmol/L NaCl、8.0mol/L尿素)平衡至基線平穩；平衡后取10mL變性溶液上樣，再用結合緩沖液洗去未與層析柱結合的雜蛋白；最后用洗脫緩沖液(pH值8.0，500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris·Cl、100mmol/L NaCl、8.0mol/L尿素)洗脫收集目的蛋白；

2.7、復性：將上述收集的目的蛋白按Bradford蛋白質定量試劑盒說明書進行蛋白含量測定；變性蛋白適量分批緩慢加到復性液，使復性液中蛋白終濃度為0.1mg/ml，2～8℃邊加邊攪拌，復性24～48小時，復性后用透析去除小分子物質；

2.8、過濾除菌：采用0.22μm濾器過濾除菌，即為干擾素半成品。

2.根據權利要求1所述的一種表達貓ω干擾素的基因工程菌的生產工藝，其特征在于，所述步驟變性中的變性液：pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、6.0-8.0mol/L鹽酸胍。