[發明專利]桿狀病毒熒光納米探針

在審

• 申請號: 202110745692.2
• 申請日: 2021-07-01
• 公開（公告）號: CN113514440A
• 公開（公告）日: 2021-10-19
• 發明（設計）人: 蘇玲玲
• 申請（專利權）人: 廣州博徠斯生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/533;G01N33/537;G01N33/569;C09K11/06
• 代理公司: 東莞市神州眾達專利商標事務所(普通合伙) 44251
• 代理人: 劉漢民

本發明公開了一種桿狀病毒熒光納米探針，先通過自生物素化標記桿狀病毒包膜糖蛋白GP64，然后利用桿狀病毒復制和自組裝過程將其基因組標記上釕復合物[Ru(phen)₂dppz]²⁺，制成熒光信號放大納米探針。本發明能夠根據病毒基因組中結合的釕復合物的熒光信號值，用于核酸的檢測與分析以及生物成像。

技術領域

本發明屬于微生物的技術領域，特別涉及一種用于細胞成像、致病菌檢測、核酸檢測等的桿狀病毒熒光納米探針。

背景技術

桿狀病毒是一類具有囊膜包裹的雙鏈環狀DNA病毒，其基因組大小為80-180kb，在自然界中以節肢動物作為專一性宿主進行感染和傳播。桿狀病毒其具有兩種不同的病毒粒子形態：一種為出芽型的病毒粒子(budded virus,BV)，主要介導細胞與細胞之間的系統感染，入侵細胞是通過受體介導的內吞作用；另一種為包埋型的病毒粒子(Occlusion-derived virus,ODV)，在病毒的口服感染過程中，節肢動物腸道堿性環境使包埋型的病毒粒子外殼脫落，萌發成具有侵染能力的病毒并感染腸道細胞達到病毒傳播。

目前已知基因組全序列的核型多角體桿狀病毒有苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒、家蠶核多角體病毒、黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒、舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒、甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒、棉鈴蟲核型多角體病毒，以及斜紋夜蛾核型多角體病毒，其中以AcMNPV研究最為深入，在生物農藥、真核表達系統等領域具有重要的應用價值。

AcMNPV的基因表達分為4個階段:立早期基因表達、早期基因表達、晚期基因表達和極晚期基因表達。

前兩個階段的基因表達早于DNA復制，而后兩個階段的基因表達則伴隨著一系列的病毒DNA合成。其中在極晚期基因表達過程中，有兩種高效表達的蛋白——多角體蛋白和P10蛋白。多角體蛋白是形成包涵體病毒的主要成分，感染后期在細胞中的積累可高達30％～50％，是病毒復制的非必需成分，但對病毒粒子有一定的保護作用。

另一類高效表達的極晚期蛋白為P10蛋白，也是一類病毒復制的非必需成分，可在細胞中形成纖維狀物質，這可能與細胞溶解有關。多角體基因和P10基因的啟動子具有較強的啟動能力，且均為病毒復制的非必需成分，因此這兩個基因位點成為了桿狀病毒表達載體系統理想的外源基因插入位點。

然而，對此的應用也局限于生物農藥、真核表達等領域。

發明內容

基于此，因此本發明的首要目地是提供一種桿狀病毒熒光納米探針，該探針能夠根據病毒基因組中結合的釕復合物的熒光信號值，用于核酸的檢測與分析以及生物成像，具有超靈敏度檢測能力，能夠提高對DNA檢測的靈敏度和準確度。

本發明的另一個目地在于提供一種桿狀病毒熒光納米探針，該探針在水化聚合物存在情況下均發光，從而產生很好的標識作用，能夠廣泛應用于細胞成像、致病菌檢測、核酸檢測。

申請人研究發現：生物素中包含有色氨酸殘基，結合力Kd值高達10-15mol/L，比抗原抗體間結合力高一萬倍，親和力高、靈敏度高、特異性強、穩定性好和多級放大作用。生物素受體多肽(簡稱AP-tag或Avi-Tag)，包含有15個氨基酸殘基組成的短肽標簽，而賴氨酸殘基反應條件溫和、專一性極高、高效、對蛋白構象及活性影響極低、操作方便；活化生物素形成生物酰-5’-腺苷酸轉移生物素到生物素受體蛋白上，形成釕復合物[Ru(phen)₂dppz]²⁺，釕復合物在水中不發光，但在非水溶劑(乙醇、乙腈)中和在水化聚合物(如DNA)存在情況下均發光，為此具有很好的標識作用。如果能將其與桿狀病毒結合，則具有良好的檢測能力。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：