[發明專利]一種石竹屬花卉中花色苷的高效液相色譜檢測方法

在審

• 申請號: 202110744538.3
• 申請日: 2021-07-01
• 公開（公告）號: CN113484432A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 傅小鵬;劉杰瑋;吳也;包滿珠;周雯潔;李嘉儀;唐逸飛;楊楊軼
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/54;G01N30/72
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種石竹屬花卉的花色苷物質成分的分離鑒定方法，其特征在于下列步驟：

(1)利用甲醇-鹽配制的水溶液作為浸提液提取石竹屬花卉中花色苷物質：準確稱取0.5-1g石竹屬花卉的花瓣樣品，在液氮中研磨至粉末狀，加入500μL甲醇-鹽酸浸提液，該浸提液的制備方法為，用含0.1％鹽酸的50％甲醇水溶液，即為甲醇-鹽酸浸提液，于渦旋儀上振蕩混勻10min，再置于冰浴超聲波清洗儀中20min，得到上清液，將所得上清液保存于進樣瓶中，待用；

(2)利用高效液相色譜質譜聯用方法進行檢測分析：將步驟(1)所得的石竹屬花卉中花色苷物質即上清液進行定性和定量分析，具體步驟為；

1)液相色譜條件：使用ACQUITY BEH C18柱，該色譜柱規格為2.1mm*100mm，1.7μm；流動相以含0.1％甲酸的超純水為A相，以含0.1％甲酸的乙腈為B相；柱溫設定為40℃，流速設定為0.35ml/min，進樣量設定為2μL；洗脫梯度為：當儀器從開始運行檢測的0.00min時，設定B相體積百分比為5％，當儀器運行檢測至5.00min時，將B相體積百分比增至20％；當儀器運行檢測至15.00min時，將B相體積百分比增至40％，當儀器運行檢測至25min時，將B相體積百分比增至100％，并保持1min；當儀器運行檢測至26min時，將B相體積百分比降至5％，并平衡至4min；

2)質譜條件：電噴霧離子源，離子源溫度設為550℃，正離子模式下質譜電壓設為5500V，氣簾氣設為35psi，負離子模式同正離子模式；

(3)在一個定量過程中，所得化合物含量按標準曲線法進行計算，具體步驟為；

1)建立標準曲線：配制所需花色苷物質不同濃度的溶液，進行梯度試驗，溶液梯度濃度分別為0.01ng/mL；0.05ng/mL；0.1ng/mL；0.5ng/mL；1ng/mL；5ng/mL；10ng/mL；50ng/mL；100ng/mL；500ng/mL；1000ng/mL；2000ng/mL；50000ng/mL，獲取各個濃度標準品的對應質譜峰面積，以所用標準品濃度為橫坐標，以獲取的質譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到如下線性方程：y＝4.58481e4x-1.70406e6，相關系數R²＝0.99781；

2)質譜數據的處理：利用Compound Discoverer3.1.1軟件處理質譜數據，確定目標物質出峰時間，去除雜峰，手動積分計算目標物質峰面積；將檢測到的目標物質的峰面積代入該物質的標準曲線線性方程中進行計算，得到該物質的相對含量，即單位為ng/mL；利用以下公式計算得到該物質在樣品中的絕對含量：某物質的絕對含量(μg/g)＝c*V/m*1×10⁶，式中c為通過標準曲線計算得到的該物質在樣品中的相對含量即ng/mL，V為所用浸提液的體積(μL)，m為稱取的樣品質量。

2.如權利要求1所述的一種石竹屬花卉的花色苷物質成分的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(1)中提取石竹屬花卉花色苷物質的方法還包括在12000rmp下離心5min，吸取上清液，重復上述離心操作三次，合并上清液，將上清液保存于進樣瓶中高效液相色譜質譜聯用(HPLC-MS)分析。

3.如權利要求1所述的一種石竹屬花卉的花色苷物質成分的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(2)中利用高效液相色譜質譜聯用檢出的花色苷物質成分進行定性分析過程中，未知化合物通過標準品比對與mzCloud數據庫檢索結合方式對其中花色苷物質成分進行定性分析，通過對目標物質與標準品的色譜圖進行對比，按照組份保留時間進行定性分析；同樣地，通過對目標物質進行二級質譜分析，判斷其與mzCloud數據庫中所含物質匹配度在98％以上的作為定性標準。