[發明專利]一種針對懸浮細胞的慢病毒載體及其應用

有效

• 申請號: 202110737586.X
• 申請日: 2021-06-30
• 公開（公告）號: CN113584085B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發明（設計）人: 黃河清濤;王德鵬;胡清云;劉彩云;許澎
• 申請（專利權）人: 湖南豐暉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;A61K48/00
• 代理公司: 長沙大珂知識產權代理事務所(普通合伙) 43236
• 代理人: 伍志祥

本發明公開了一種針對懸浮細胞的慢病毒載體及其應用，屬于生物技術領域。本發明中的慢病毒載體是以pLVX?EGFP?IRES?Puro為框架，插入了Ubi啟動子和Cbh啟動子。該慢病毒載體普遍適用于懸浮細胞的表達，表達效率高效、穩定，能夠極大程度地提升懸浮細胞中的過表達效果，且表達過程簡單易行，易于推廣。

技術領域

本發明涉及一種針對懸浮細胞的慢病毒載體及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

慢病毒(lentivirus,LV)是目前細胞及模式生物實驗中非常有效的工具，在基因轉染方面有著許多獨特的優勢。關于慢病毒載體(Lentiviral?vector)的研究發展得很快，研究得也非常深入。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。慢病毒載體較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。

慢病毒表達載體，即通常所說的穿梭載體，包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。

與其他逆轉錄病毒相比，慢病毒有其獨特的優點。

(1)有更廣泛的宿主，對于分裂和非分裂細胞均具有感染能力。對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉導效率，使目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加。

(2)穩定表達。慢病毒可以將外源基因有效的整合到細胞染色體中，且目的基因對轉錄沉默作用有一定的抵抗能力，可以在靶細胞中得到持續高效穩定的表達。

(3)經過構建后的慢病毒載體可以攜帶大約5kb，甚至更長的目的基因。因此除了外源的short-hairpin?RNAs(shRNAs)等小分子外，很多cDNA也能被克隆進入慢病毒載體，當然隨著目的基因長度的增加，其病毒滴度也會隨之下降。

基于慢病毒的優點，可以利用慢病毒載體系統進行轉染目的基因或RNAi基因的常規實驗操作，同時慢病毒在基因編輯、基因治療、轉基因動物、藥物研究等領域也發揮著重要作用。

常見的血液腫瘤主要包括各類白血病、多發性骨髓瘤以及惡性淋巴瘤，目前發病率都排在惡性腫瘤的前十位。因此血液腫瘤是當前的研究熱點之一。但是眾所周知，血液來源的懸浮細胞，普遍存在難以慢病毒感染的問題。

所以，開發一種懸浮細胞專用的慢病毒載體，有很高的臨床和市場價值。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種針對懸浮細胞的慢病毒載體及其應用，該慢病毒載體適用于懸浮細胞的表達，表達效率高效、穩定，能夠極大程度提升懸浮細胞中過表達效果，且表達過程簡單易行，易于推廣。

本發明的技術方案如下。

本發明提供了一種慢病毒載體，是以pLVX-EGFP-IRES-Puro為框架，插入了Ubi啟動子和Cbh啟動子。

進一步地，所述Ubi啟動子和Cbh啟動子替換了pLVX-EGFP-IRES-Puro中的CMV啟動子。

進一步地，所述Ubi啟動子和Cbh啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明還提供了含上述慢病毒載體的重組慢病毒。

本發明還提供了一種上述重組慢病毒的制備方法，是將目的基因導入上述慢病毒載體得到目的質粒，將目的質粒與psPAX2和pMD2.G共轉染宿主細胞得到的重組慢病毒。