[發(fā)明專(zhuān)利]一種以基因工程水稻表達(dá)和制備重組瑞替普酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110735731.0
• 申請(qǐng)日: 2021-06-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113337493B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊代常;余文卉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 武漢禾元生物科技股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/64
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/64;C12N15/84
• 代理公司: 北京律誠(chéng)同業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

1.一種以基因工程水稻表達(dá)和制備重組瑞替普酶的方法，依次包括以下步驟：

(1)構(gòu)建在水稻種子中表達(dá)重組瑞替普酶的植物表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體是將如SEQ ID NO.1所示的經(jīng)水稻密碼子優(yōu)化的瑞替普酶基因，與水稻特異性啟動(dòng)子Gt13a及其信號(hào)肽導(dǎo)入質(zhì)粒載體構(gòu)建；

(2)用步驟(1)所述的表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化水稻，獲得基因工程水稻，栽培后獲得重組瑞替普酶基因工程水稻種子；

(3)從步驟(2)所述的重組瑞替普酶基因工程水稻種子中提取含重組瑞替普酶的粗提取物；

其中，步驟(3)所述重組瑞替普酶粗提物的制備方法包括：

3a)將步驟(2)獲得的重組瑞替普酶基因工程水稻種子曬干脫殼，加工成半精米，研磨成80～100目的米粉；

3b)將上述米粉與提取液按照1：5(重量/體積，kg/L)的比例混勻，在24～26℃提取2～3小時(shí)，獲得提取混合物；所述提取液的成分為：20mM磷酸鹽緩沖液，500mM氯化鈉，pH7.5；

3c)將步驟(3b)的提取混合物加入2％-5％的珍珠巖壓濾，濾液再經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾后即為重組瑞替普酶的粗提取物；

(4)將步驟(3)獲得的含重組瑞替普酶的粗提取物經(jīng)陽(yáng)離子交換層析，得到初級(jí)產(chǎn)物I，所述離子交換層析的介質(zhì)為NanoGel 50sp；

其中，步驟(4)所述重組瑞替普酶初級(jí)產(chǎn)物I通過(guò)下述方法制備：

4a)采用4-6倍柱體積的pH為6.5的20mM磷酸鹽和130mM氯化鈉緩沖液，以200～250cm/h的線(xiàn)性流速平衡NanoGel 50sp層析柱；

4b)將步驟(3)獲得的重組瑞替普酶粗提取物與pH6.5的20mM磷酸鹽緩沖液按照體積比1：2.5混勻稀釋?zhuān)?.22μm濾膜過(guò)濾后作為上樣液，上樣液電導(dǎo)為14～16mS/cm，其中上樣液pH為6.4～6.6，上樣體積不超過(guò)221CV；

4c)采用pH為6.5的20mM磷酸鹽和180mM氯化鈉緩沖液，以200～250cm/h的流速進(jìn)行40CV雜質(zhì)蛋白洗脫，洗雜緩沖液電導(dǎo)為20mS/cm；

4d)采用pH為6.5的20mM磷酸鹽和280mM氯化鈉緩沖液，以200～250cm/h的流速進(jìn)行50CV重組瑞替普酶的洗脫，洗脫緩沖液電導(dǎo)為28～32mS/cm，收集富含重組瑞替普酶的洗脫液，獲得含重組瑞替普酶的初級(jí)產(chǎn)物I；

(5)將步驟(4)獲得的初級(jí)產(chǎn)物I經(jīng)疏水層析，得到含重組瑞替普酶的中級(jí)產(chǎn)物II，所述疏水層析介質(zhì)為UniHR Phenyl 30L；

其中，步驟(5)所述重組瑞替普酶中級(jí)產(chǎn)物II是通過(guò)下述方法制備：

5a)采用5～10CV的pH6.5，20mM磷酸鹽和0.37M硫酸銨緩沖液，以350～400cm/h的流速平衡UniHR Phenyl 30L層析柱；

5b)用3M硫酸銨調(diào)節(jié)重組瑞替普酶初級(jí)產(chǎn)物I的電導(dǎo)為59～61mS/cm，pH調(diào)整為6.5，作為上樣液，上樣液電導(dǎo)為60mS/cm，全部上樣；

5c)采用pH6.5，含0.5％甘油的20mM磷酸鹽和260mM硫酸銨的緩沖液進(jìn)行20CV雜質(zhì)蛋白洗脫，洗雜緩沖液電導(dǎo)為45mS/cm；

5d)采用pH6.5，含0.5％甘油的20mM磷酸鹽和68mM硫酸銨的緩沖液進(jìn)行20CV重組瑞替普酶的洗脫，洗脫緩沖液電導(dǎo)為15mS/cm，收集富含重組瑞替普酶的洗脫液，獲得含重組瑞替普酶的中級(jí)產(chǎn)物II；

(6)將步驟(5)獲得中級(jí)產(chǎn)物II經(jīng)苯甲脒親和層析，得到純化的重組瑞替普酶，所述苯甲脒親和層析介質(zhì)為博格隆Benzamidine Bestarose 4FF；

其中，步驟(6)所述純化的重組瑞替普酶是通過(guò)下述方法制備：

6a)采用5～10CV的pH7.5，20mM磷酸鹽和68mM硫酸銨緩沖液，以350～400cm/h的流速平衡博格隆Benzamidine Bestarose 4FF層析柱；

6b)將中級(jí)產(chǎn)物II的pH調(diào)整為7.5，作為上樣液，全部上樣；

6c)采用pH6.0的20mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行10CV雜質(zhì)蛋白洗脫；

6d)采用pH4.8～5.2的20mM磷酸鹽和20mM醋酸鹽緩沖液進(jìn)行5CV重組瑞替普酶的洗脫，洗脫緩沖液的pH為5.0，收集富含重組瑞替普酶的洗脫液，獲得純化的重組瑞替普酶。