[發明專利]釀酒酵母內源角鯊烯單加氧酶突變體及應用

在審

• 申請號: 202110732545.1
• 申請日: 2021-06-30
• 公開（公告）號: CN113444701A
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 曾偉主;周景文;劉松;夏路;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12P5/02;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了釀酒酵母內源角鯊烯單加氧酶突變體及應用，屬于基因工程和酶工程技術領域。本發明提供的釀酒酵母角鯊烯單加氧酶突變體G27S、G30S、G25S、Y90F、Y90A、Q63N、C416A、I483A、G27S/Y90A、G27S/I483A、Y90A/I483A、G27S/Y90A/I483A的酶活性比野生型均有不同程度的降低，表達上述突變體的釀酒酵母胞內角鯊烯產量可提高了40％以上，角鯊烯積累量可高達6.82g/L，有利于擴大其工業化應用范圍，實現大規模的安全生產。

技術領域

本發明涉及釀酒酵母內源角鯊烯單加氧酶突變體及應用，屬于基因工程和酶工程技術領域。

背景技術

角鯊烯(squalene)是一種重要的萜類化合物，它是許多生物活性化合物的前體，如類固醇和藿烯等。角鯊烯本身具有較高的應用價值，可用于化妝品行業作為潤膚霜。角鯊烯對人體健康也有益，具有包括抗腫瘤、抗真菌/真菌，增強機體免疫能力，降低膽固醇等作用。另外，角鯊烯還有一種重要的用途是制作穩定的乳化液，例如疫苗、藥物及其他的藥用底物。目前，角鯊烯傳統的生產方法主要通過非法手段從鯊魚肝提取或低效的從植物中提取，但鑒于其來源有限，價格昂貴，利用微生物生產角鯊烯具有可持續性，環境友好等的優點，故與傳統角鯊烯生產相比采用微生物發酵法生產角鯊烯具有很好的前景。

角鯊烯的合成從乙酰輔酶A開始，首先通過HMG-CoA合成酶催化生成3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)，接下來HMG-CoA還原酶(HMGR)催化HMG-CoA生成甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)，是MVA途徑中第一個限速酶，IDI1編碼的異戊烯焦磷酸酯異構酶催化異戊烯二磷酸(IPP)形成烯丙基二磷酸(DMAPP)，其與HMG1是細胞質萜類化合物的代謝中的重要調控點。接下來通過一系列Erg蛋白酶催化，角鯊烯合成酶(Erg9p)將法尼烯基焦磷酸(FPP)催化形成角鯊烯。角鯊烯單加氧酶Erg1催化2,3-環氧角鯊烯的形成。天然釀酒酵母MVA途徑中角鯊烯幾乎不積累。現有技術中有文獻記載了對釀酒酵母進行基因工程改造提高角鯊烯產量的方案，但仍存在發酵周期長、產量有限等問題。

目前，角鯊烯主要以微生物發酵的方式生產。釀酒酵母菌Saccharomycescerevisiae是最主要的生產菌株，針對釀酒酵母菌生產角鯊烯的研究主要集中在提高角鯊烯產量和產率等方面。角鯊烯單加氧酶是催化角鯊烯生成環氧角鯊烯的關鍵酶，研究人員發現特比萘芬能有效抑制角鯊烯單加氧酶的催化活性，而特比萘芬作為抗生素添加為角鯊烯的工業化生產應用帶來困難。如何選擇合適的方式對角鯊烯單加氧酶進行改性，獲得理想的角鯊烯單加氧酶活性，在保持低活性的基礎上不影響酵母細胞生長，從而擴大其工業應用是目前亟待解決的問題。

已有研究對人源的角鯊烯單加氧酶進行蛋白質結構的解析，并對不同來源的角鯊烯單加氧酶進行蛋白質序列的比對，但目前還沒有報道對釀酒酵母來源的ERG1的蛋白質結構及功能研究。因此，篩選具有低角鯊烯催化活性的角鯊烯單加氧酶對于改造高產角鯊烯的釀酒酵母菌株具有重要的意義。

發明內容

針對目前存在的問題，本發明利用基因工程和酶工程的手段，降低角鯊烯單加氧酶的活性，提高角鯊烯的產量，為其工業化生產創造了條件。

本發明提供了如下(a)或(b)的角鯊烯單加氧酶突變體：

(a)在SEQ ID NO.1的氨基酸基礎上，第25位、27位、30位、63位、90位、416位或483位進行了一個或多個突變的角鯊烯單加氧酶突變體，

(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有角鯊烯單加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質。

在一種實施方式中，所述親本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。