[發明專利]一種改造大腸桿菌利用棕櫚粕發酵的工程菌株及其應用

有效

• 申請號: 202110723743.1
• 申請日: 2021-06-29
• 公開（公告）號: CN113444676B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 金鵬;杜琪珍;王滿
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/26;C12P19/14;C12P19/00;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種改造大腸桿菌利用棕櫚粕發酵的工程菌株及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明重組表達的β?1,4外切甘露糖苷酶能夠有效的將甘露聚糖分解成甘露寡糖，從而本發明改造的工程菌株得以在以甘露聚糖為底物的棕櫚粕培養基中實現高效的生長速率；同時本大腸桿菌工程菌株的透明質酸產量可達57mg/L。本發明為大腸桿菌以棕櫚粕為碳源發酵的利用奠定了一定的基礎，而透明質酸的生產也適合于工業化應用。

技術領域

本發明涉及一種改造大腸桿菌利用棕櫚粕發酵的工程菌株及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

棕櫚粕是棕櫚油工業的農業副產物，盛產于東南亞地區，年產量約992萬噸。棕櫚仁餅是近年來棕櫚油工業的主要廢棄物之一，是棕櫚仁經壓榨和榨油后的45種主要廢棄物。棕櫚粕含有大量的碳水化合物，其中棕櫚仁粕的81％的碳水化合物以非淀粉多糖形式存在，而非淀粉多糖又主要以不溶性的非纖維素多糖為主，不溶性非纖維素多糖中含有甘露糖和葡萄糖(Knudsen，1997)，甘露聚糖是其主要成分之一，約占干重的40％。根據馬來西亞棕櫚油委員會(mpob)提供的統計數據446，2015年馬來西亞47個棕櫚油工業生產了2519990噸棕櫚粕副產物(PKC)，棕櫚粕含有相對較高的碳水化合物，而其碳水化合物主要由大量的甘露聚糖組成，甘露聚糖也是棕櫚粕中重要的半纖維素，主要存在于以線性D甘露聚糖骨架連接而成，因此是生物精煉系統和工業生化過程的潛在的優質原料。甘露聚糖是高度分支的多聚體，以α-1,6-甘露糖為骨架鏈，大部分甚至全部的殘基具有α-1，2或α-1，3連接的含有2～5個甘露糖殘基的側鏈。甘露聚糖酶，即β-甘露聚糖酶能催化甘露聚糖水解為低聚糖或單糖，是一種重要的半纖維素酶，也是甘露聚糖降解過程的關鍵酶。甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶家族5、26和113，它通過隨機的斷裂甘露聚糖鏈來水解甘露聚糖的主鏈，從而釋放不同數量的甘露寡糖以及單糖。

考慮到棕櫚粕具有豐富的甘露聚糖，且價格低廉，目前的研究主要利用棕櫚粕提取多種種甘露聚糖。通過優化物理和生物酶催化協同反應的操作工藝，分離提取到較高純度的可用于微生物發酵的寡糖，然后將其應用于菌體發酵法生產其他發酵產品的工藝中。

發明內容

[技術問題]

提供一種以棕櫚粕為碳源發酵生產的基因工程菌。

[技術方案]

為了能實現對棕櫚粕中甘露聚糖的直接利用，本技術將一個性能優異的嗜熱β-1,4外切甘露糖苷酶TFMS導入大腸桿菌BL21(DE3)中進行分泌表達，從而構建一個可以直接利用棕櫚粕作為碳源的的底盤工程菌株，此菌株通過直接分泌胞外的β-1,4外切甘露糖苷酶水解釋放棕櫚粕中的甘露聚糖，得到多種寡糖甚至單糖，直接供細胞利用，這為棕櫚仁餅生產甘露寡糖以及促進細胞生長和生物合成奠定了技術基礎。

本發明提供了一種基因工程菌，可以利用棕櫚粕這種農業副產物為碳源進行發酵。

在一種實施方式中，所述基因工程菌以大腸桿菌為出發菌株，基因組的malZ位點上整合有由編碼甘露糖苷酶的基因TFMS，信號肽，組成型T7啟動子和核糖體結合位點序列組成的操縱子；所述組成型T7啟動子和核糖體結合位點序列在信號肽的上游，所述信號肽在基因TFMS的上游。

在一種實施方式中，所述信號肽包含ompA、Dsba或pelB。

在一種實施方式中，所述ompA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、Dsba的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示或pelB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一種實施方式中，所述組成型T7啟動子和核糖體結合位點序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一種實施方式中，所述編碼甘露糖苷酶的基因TFMS的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在一種實施方式中，所述大腸桿菌包括但不限于大腸桿菌BL21(DE3)。