[發明專利]一種木本植物蘋果果實細胞液泡蛋白的提取方法

在審

• 申請號: 202110708573.X
• 申請日: 2021-06-25
• 公開（公告）號: CN113403253A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 胡大剛;向瑩;王菲;陳修正;孫翠慧
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

1.一種木本植物蘋果果實細胞液泡蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以蘋果果實為實驗試材，從蘋果果肉細胞中提取出原生質體；

(2)對步驟(1)中得到的原生質體進行分離得到液泡；

(3)對步驟(2)中得到的液泡進行超低溫凍融處理，得到蘋果果實細胞液泡蛋白；

(4)對步驟(3)中得到的液泡蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最終確定獲得蘋果果實細胞液泡蛋白。

2.根據權利要求1所述的原生質體提取方法，其特征在于，步驟(1)中，將蘋果果肉加入滅菌的培養皿中并碾碎，再加入處理后的細胞壁酶解液，混勻，避光處理，放在露天搖床上，室溫下酶解2-3小時；酶解完畢后加入W5緩沖液混勻，再用尼龍網紗進行過濾，將過濾好的材料在室溫下靜置或離心，得到沉淀即為原生質體。

3.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述細胞壁酶解液是將4ml甘露醇(1M)、200μl KCl(1M)、402μl MES(0.5M)、0.2g蔗糖、0.15g纖維素酶R-10、0.04g離析酶R-10、0.005g果膠酶Y-23用ddH₂O定容至10ml得到的；所述處理為：將配置好的細胞壁酶解液在55℃下加熱10分鐘，再將細胞壁酶解液在0℃下冷卻5分鐘，然后加入100μlCaCl₂(1M)。

4.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述W5緩沖液是將6.16ml NaCl(5M)、25ml CaCl₂(1M)、1ml KCl(1M)、0.8ml MES(0.5M)用ddH₂O定容至200ml得到的。

5.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)中，所述分離的方法為：向步驟(1)得到的原生質體中加入裂解緩沖液，混勻，然后在室溫條件下靜置；再加入4％聚蔗糖溶液，后加入液泡緩沖液，然后進行離心；離心后將各個離心層分離并分裝，得到液泡；所述4％聚蔗糖溶液由液泡緩沖液和裂解緩沖液混合得到的。

6.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述裂解緩沖液是將3ml甘露醇(1M)、5ml30％(wt)聚蔗糖、300μl EDTA(0.5M)、375μl第一磷酸鈉緩沖液、75μl0.1％中性紅溶液用ddH₂O定容至15ml得到；所述裂解緩沖液在37℃水浴下保存。

7.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述液泡緩沖液是將4.5ml甘露醇(1M)、250μl第二磷酸鈉緩沖液、40μl EDTA(0.5M)用ddH₂O定容至10ml得到；所述液泡緩沖液放置在冰上保存。

8.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(3)中，所述超低溫凍融方法為：將步驟(2)得到的液泡在-80℃下過夜冰凍，將液泡凍碎，得到液泡蛋白。

9.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(4)中，所述SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的方法為：將步驟(3)中得到的液泡蛋白取出后放置在冰上融化，待其完全融化后，加入上樣緩沖液，充分混勻以后，在沸水中煮制，煮制完成后進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時，跑膠跑到濃縮膠和分離膠分界面之前調節電壓為110V，到達該分界面時調節電壓為130V。