[發明專利]一種小鼠原代肝臟枯否細胞的提取方法

在審

• 申請號: 202110706246.0
• 申請日: 2021-06-24
• 公開（公告）號: CN113604419A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 南曉慧;方巧君
• 申請（專利權）人: 國家納米科學中心
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

本發明涉及一種小鼠原代肝臟枯否細胞的提取方法。本發明提供的提取方法包括：采用一次性輸液裝置進行緩沖液灌注，結合膠原酶灌注進行肝臟消化處理；小鼠肝臟靜脈灌流消化后，撕碎肝包膜進行肝臟組織過濾；過濾后多次離心處理獲得高純度的肝臟組織細胞。本發明提供的方法能夠在保證細胞純度的基礎上，使得細胞保持較好活性。采用本發明所提供的提取方法分離出小鼠肝臟枯否細胞的效率更高，小鼠肝臟枯否細胞提取量維持在5×10⁶?8×10⁶個。本發明提供的方法使用設備簡單易得，為不具備蠕動泵的實驗室提供了極大的便利，所用一次性輸液裝置成本低，并可更好的滿足細胞提取過程的無菌操作要求。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，是一種簡單易行具有普適性的小鼠原代肝臟枯否細胞的提取方法。

背景技術

肝臟是一個重要的代謝器官，由多種細胞組成，其中肝實質細胞約占細胞總數的65％，肝臟內皮細胞、星狀細胞、枯否細胞、肝臟相關淋巴細胞等非實質細胞占35％。同時肝臟也是重要的免疫活性器官，也被稱為淋巴組織樣器官，機體單核-巨噬細胞90％在肝臟，肝臟內的枯否細胞是機體單核-巨噬細胞的主要成分，占肝臟內細胞總數的25％；多數研究提取原代枯否細胞采用非灌流法即機械法將組織剪成小塊再通過擠壓、剪碎和震蕩等機械手段使細胞從組織上脫落從而獲得分離的細胞。另外一種非灌流法提取細胞是將肝臟組織剪碎后利用膠原酶或胰酶消化破壞細胞間的橋連或纖維成分進行細胞分離。但這種非灌流技術雖操作簡單易行但分離細胞時往往存在著消化不完全、分離得到的細胞中存在多細胞團塊等問題，不能很好地滿足研究者所需。

1969年，Berry和Friend引入了灌流法提取原代細胞，灌流過程可使消化液與肝組織更加充分地接觸，不僅提高了分離效率，還使分離所得細胞的活力和數量大大提升。灌流法已在多位研究者的努力改良下發展出了多種方法，如原位膠原酶灌注法、半原位膠原酶灌注法、離體膠原酶灌注法等。常用的是原位膠原酶灌注法，但該法依賴于蠕動泵，對于偶爾提取幾次原代細胞進行研究的實驗室來說，這無疑會造成實驗設備的浪費，且往往因為靜脈過細較難以實現理想的灌注效果。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種簡單易行具有普適性的小鼠原代肝臟組織細胞的提取方法。

現有技術中，常參考大鼠原代肝臟細胞的提取方法，采用原位灌注膠原酶與蠕動泵結合，進行小鼠原代肝臟細胞的提取。由于小鼠門靜脈非常細，采用蠕動泵時，灌注壓力不易控制，且對于少量提取小鼠原代肝臟細胞的實驗室來說，不依賴蠕動泵的提取方法更方便易行。

因此，本發明第一方面提供一種小鼠原代肝臟枯否細胞的提取方法，使用緩沖液從小鼠門靜脈處原位灌注，從下腔靜脈末端排出，肝臟顏色由暗紅變為黃色后；使用膠原酶替換緩沖液進行灌注，膠原酶灌注時間維持6-10min。

本發明提供的提取方法，簡單易行，不依賴蠕動泵，灌注壓力適中，且本發明在灌注過程中，不用考慮小鼠的生存狀況，即灌注過程中，小鼠心臟保持跳動或停止跳動均不影響紅細胞隨著緩沖液排出。

本發明還發現，在實驗中，由于小鼠門靜脈直徑很小，進行膠原酶灌注時，偶有注射器扎穿門靜脈的情況出現。為了解決此問題，在本發明提供的提取方法中，采用緩沖液正向原位灌注結合膠原酶逆向原位灌注消化肝臟組織；即在使用膠原酶灌注時，可以從下腔靜脈處灌注，從門靜脈處排出。

本發明發現，在進行膠原酶原位灌注時，除了可以采用膠原酶正向原位灌注(從門靜脈灌注，從下腔靜脈排出)，為了解決小鼠門靜脈過細，原位灌注不好操作等缺陷，也可以采用膠原酶逆向灌注(下腔靜脈處灌注，從門靜脈處排出)。

本發明通過正向緩沖液原位灌注結合逆向膠原酶原位灌注的方法實現高活性高產率的細胞提取，為原代肝臟細胞提取提供一種新思路新途徑。