[發明專利]一種3D打印制備金屬墊塊用于髖臼骨缺損重建的方法

在審

• 申請號: 202110703088.3
• 申請日: 2021-06-24
• 公開（公告）號: CN113425462A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 方盛;李歡;徐鵬;王益民;孫曉亮
• 申請（專利權）人: 常州市第一人民醫院
• 主分類號: A61F2/34
• 分類號: A61F2/34
• 代理公司: 南通毅帆知識產權代理事務所(普通合伙) 32386
• 代理人: 任毅

1.一種3D打印制備金屬墊塊用于髖臼骨缺損重建的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、電子束熔融3D打印的鈦金屬植入物的制備、表征以及細胞相容性檢測；

A1、電子束熔融3D打印的鈦金屬植入物的制備：

工程師在UG軟件中分別繪制出直徑為1.5cm高度為0.5cm以及直徑為0.4cm高度為0.15cm的圓柱形人工墊塊的三維數字模型圖，并將數據以STL格式保存并導入3D打印主程序中進行分層切片處理，再將獲得的各斷層數據導入EBM設備，進行產品的打印制作；

在粉倉內裝入鈦合金(Ti6Al4V)粉末，由粉耙均勻鋪設在工作平臺上，厚度為0.5～1mm；關閉艙門，工作艙抽至真空，真空度需達到10-4～10-5mbar；電子束槍在電腦程序控制下發射高能電子束并聚焦至工作平臺，受到高能電子束照射的鈦金屬粉末顆粒瞬間被加熱熔融再經冷卻凝固，通過分層加工、疊加成型的方式打印出所需要的金屬定制物；去除未熔融的金屬粉末，并經后續的拋光加工等處理即可獲得最終的個性化金屬墊塊成品，經消毒后無菌存放備用；

B1、電子束熔融3D打印的鈦金屬植入物的孔隙率檢測；

孔隙率的測定：采用排液法測定孔隙率；取直徑為1.5cm高度為0.5cm圓柱形3D打印人工墊塊及傳統成品人工墊塊，將其浸沒在已知體積(V1)的無水乙醇中，減壓使乙醇充滿支架內部所有孔隙，總計體積為V2；一段時間后，輕輕取出支架，剩余乙醇體積標記為V3；孔隙率由公式(a)得到；

Porosity＝(V1–V3)/(V2–V3) (a)

C1、電子束熔融3D打印的鈦金屬植入物的表面結構觀察；

形貌及結構：分別將3D打印人工墊塊及傳統成品人工墊塊在20mA條件下噴金2min制備樣品，用掃面電鏡觀察其表面結構以及孔隙大小等；

D1、電子束熔融3D打印的鈦金屬植入物的抗壓強度測試；

分別取直徑為1.5cm高度為0.5cm圓柱形3D打印人工墊塊及傳統成品人工墊塊各6個式樣，在37℃、100％相對濕度環境中養護72小時，上下表面打磨平整，置于萬能試驗機上進行壓縮測試；加載速率為1mm/min，記錄載荷-位移曲線；按照以下公式(b)計算得出式樣的抗壓強度值：

P＝4NπD2 (b)

式中P代表式樣的抗壓強度，N代表載荷峰值，D代表式樣的直徑；

S2、電子束熔融3D打印的鈦金屬植入物生物學特性的體外表征；

A2、成骨細胞的培養；

將MC3T3-E1細胞系用0.25％Trypsin-EDTA消化、計數，取1×107個細胞，接種于直徑為75cm2的細胞培養皿中，于37℃、5％CO2條件下培養，每皿加入8～10mL培養基，隔天換液；待細胞90％融合后，用0.25％Trypsin-EDTA消化傳代；

B2、細胞在材料表面黏附增殖的形態學檢測；

將直徑為1.5cm高度為0.5cm圓柱形3D打印人工墊塊及傳統成品人工墊塊進行輻照滅菌以用于生物學試驗；兩種墊塊各取30個置入24孔板中，一個墊塊對應一孔，加入細胞培養基于37℃、5％CO2條件下浸泡3天后，每孔植入1×105個MC3T3-E1細胞，另取15孔無材料孔亦植入1×105個MC3T3-E1細胞作為空白對照；

分別于第1、3、7、14、21天從各組各取3孔吸去培養基并用PBS溶液清洗后，加入4％多聚甲醛固定10分鐘；隨后用2％BSA溶液封閉2小時，封閉結束后于避光環境下依次加入工作濃度為5μg/mL的FITC-鬼筆環肽溶液和DAPI溶液，各反應20分鐘，反應結束后均吸除反應溶液并用PBS溶液清洗；將染色后的樣品置于熒光顯微鏡下觀察各組材料表面細胞形態、數量以及孔隙內細胞長入情況，并與空白對照組細胞形態相對比；

另對各時間點的各組細胞-墊塊復合物行SEM檢測；第1、3、7、14、21天時于3D打印人工墊塊組及傳統成品人工墊塊組各取出3個樣品以PBS洗凈，并以1％鋨酸于4℃固定4小時，隨后采用酒精梯度脫水，各濃度脫水時間不小于20分鐘；完成脫水后空氣干燥，并抽真空、噴金，采用SEM觀察墊塊表面細胞的數量、數量以及孔隙內細胞長入情況；

C2、墊塊生物相容性的定量檢測；

將直徑為0.4cm高度為0.15cm3D打印人工墊塊及傳統成品人工墊塊置于96孔板中，另設無材料對照組，于各孔中植入1×104個MC3T3-E1細胞進行培養，取第1、3、7、14、21天作為觀察點行MTS法檢測分析；于各時間點各組取3孔，吸盡孔內的培養基，并用PBS溶液清洗后再于各孔內加入100mL細胞完全培養基及20μL、1.90mg/mL的MTS溶液，并于細胞培養箱內孵育3小時后從各孔內吸出100μL于新孔中，運用紫外分光光度儀檢測490nm波長處的OD值，記錄結果，繪制各組細胞生長曲線；

S3、電子束熔融3D打印的鈦金屬植入物生物學特性的體內表征；

A3、山羊股骨缺損模型的建立及材料植入術前先采用電子束熔融3D打印技術制備φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm的鈦金屬墊塊，輻照滅菌消毒后無菌存放備用；

選取重20～25kG青山羊；提前送至動物中心分籠飼養一周以適應環境；試驗開始前肌注速眠新(0.15mL/kG)麻醉成功后,將山羊右側臥位固定于實驗臺上，后肢備皮,用2.5％碘酒、75％酒精棉球消毒、鋪巾；取股骨外側下端縱向切口長約5cm，依次切開皮膚、皮下組織、闊筋膜，顯露外側股骨髁，采用電鉆鉆取出φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm缺損；并將各組無菌保存的材料置入缺損部位；其中，傳統成品人工墊塊組以運用各種大小的成品墊塊盡可能填滿缺損為宜；假手術組中，只行皮膚及肌肉的切開與縫合，不行股骨髁鉆孔及樣品置入；隨后，采用生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合，無菌敷料包扎，不作外固定，自由活動；術前、中及術后3天肌注青霉素8萬單位，鏈霉素0.5g；高蛋白青飼料圈養,術后12天拆線；

B3、體內缺損填補修復檢測；

B31、Micro-CT檢測:

術后4、8、12周采用速眠新對青山羊進行麻醉后，行CT檢測，同時用相關軟件分析骨體積分數(BoneVolume/TotalVolume，BV/TV)、骨密度(BoneMineralDensity，BMD)等指標，并進行缺損部位三維重建以直觀了解缺損填補、骨長入及缺損修復情況；

B32、組織形態學觀察:

第4、8、12周時處死山羊，取出包含樣品的組織制作切片；分別行HE及MASSON三色染色，并于光學顯微鏡下觀察缺損填補、骨長入及缺損修復情況；

HE染色具體步驟為：將切片再次進行梯度脫水后加入蘇木精溶液中染色5分鐘，流水洗凈后采用1％鹽酸乙醇處理3秒，再行水洗藍化30分鐘后酒精梯度脫水，并采用伊紅染色20秒，采用純乙醇脫水并經二甲苯使切片透明，中性樹膠封固；

MASSON三色染色具體步驟為：將切片進行鉻化處理后采用Weiger鐵蘇木素染色10分鐘，用酸性乙醇分化液分化，并用MASSON藍化液返藍；隨后采用麗春紅品紅染色液染色10分鐘后用磷鉬酸溶液分化2分鐘，再用苯胺藍染色液染色2分鐘；95％乙醇及無水乙醇依次脫水后，采用二甲苯使切片透明，中性樹膠封固；

S4、電子束熔融3D打印的鈦金屬植入物的臨床研究；

A4、電子束熔融(EBM)3D打印制作個體化多孔金屬墊塊；

根據外科醫生術前規劃結果，通過前述辦法制備電子束熔融3D打印個體化多孔金屬墊塊，并采用輻照滅菌后無菌封存以備術中使用；

B4、前期實驗都成功后，倫理委員會批準，報批相關手續，建立傳統成品人工墊塊對照組，進行臨床植入試驗；

研究對象的篩選:

患者術前拍攝骨盆正位X線片，根據X線片髖臼旋轉中心上移程度、坐骨骨溶解、淚滴骨溶解及Kohler線是否破壞等情況對髖臼側骨缺損進行Paprosky分型評估；

入選標準：PaproskyⅡB及以上嚴重骨缺損類型；

排除標準：(1)PaproskyⅠ、ⅡA型骨缺損，由于該型骨缺損較小通常無需進行植骨；(2)對金屬植入物過敏者；(3)合并其他嚴重疾病或全身評估不能耐受手術者；(4)伴有髖關節感染或全身其他部位活動性感染者；(5)嚴重骨質疏松者；(6)除髖關節以外，下肢的其他關節(膝、踝)疾患致功能嚴重受損影響下肢功能評估者；(7)篩選前6個月有酒精或藥物濫用史；(8)懷孕或哺乳期婦女，或期望生育的婦女；

C4、骨盆數字化三維模型的建立

術前采用金屬去偽影技術，利用64層螺旋CT對患者的骨盆進行層厚1mm的薄層掃描；CT圖像文件以DICOM格式保存,并導入交互式醫學影像控制系統,重建患者的骨盆數字化三維模型圖；

D4、1:1半骨盆3D模型的制作；

將MIMICS軟件建立的數字化三維骨盆模型數據導入工業設計軟件UG中進行進一步繪制加工，最后導入到3D打印機主程序中以聚乳酸為原料，按照逐層打印的方式制作出真人大小的1:1半骨盆模型；

E4、骨缺損的評估及手術方案的規劃；

根據MIMICS軟件獲得的三維重建圖像及1:1半骨盆3D實體模型進一步評估患者髖臼骨缺損情況，包括髖臼前壁、后壁、內壁、臼頂等的骨缺損量、外形以及殘存宿主骨量等情況；根據骨缺損情況，利用計算機輔助設計規劃出個性化墊塊的三維模型，在重建圖像上繪制出其外形、大小及最佳放置位置、螺釘固定數量、方向等，同時確定翻修假體髖臼金屬外杯的大小及安裝位置，并生成三維效果圖；經手術醫生確認滿意后，根據計算機輔助設計的墊塊樣式利用EBM3D打印機制作出實體墊塊模型，由外科醫生在1：1半骨盆模型上進行術前手術操作模擬，評估髖臼骨缺損的預填充效果；

F4、翻修手術置入3D打印內植物重建骨缺損；

經醫院倫理委員會批準，告知患者并簽署手術及植入物知情同意書；手術均由本課題組醫生完成；手術采用改良Harding入路切開暴露，術中徹底清創并取出松動假體，臼杯周圍骨溶解和骨缺損與術前3D打印半骨盆模型所示一致；髖臼側經磨搓后按照術前計劃方案在髖臼骨缺損處置入3D打印鈦金屬墊塊，并按術前設計制作的釘孔方向置入螺釘固定；安放金屬臼杯，壓配牢靠后安裝聚乙烯內襯，最后置入生物型股骨柄假體并安裝陶瓷球頭；

G4、術后臨床療效及生物力學評估:

①與同種異體結構性植骨和使用成品金屬墊塊的翻修手術建立對照，對比術中時間、出血量、術中并發癥情況；

②術后1、3、6、9、12個月對患者進行跟蹤隨訪，評估VAS疼痛評分、Harris功能評分；

③拍攝骨盆X線平片及薄層CT，評估內植物位置以及骨長入情況；

④檢測患者血液中V、Al等相關金屬離子濃度，評估假體的生物毒性。