[發明專利]基于DNA四面體的間充質干細胞外泌體制劑及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110698753.4
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113289028B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 李振華;張金超;李航;劉會芳
• 申請（專利權）人: 河北大學
• 主分類號: A61K47/54
• 分類號: A61K47/54;A61K47/46;A61K31/711;A61K47/64;A61K47/69;A61K35/28;A61K31/704;A61P35/00;A61P39/02;A61P1/16;A61P9/00;C12N5/0775
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 張莉靜

1.一種基于DNA四面體的間充質干細胞外泌體制劑，其特征是，所述外泌體制劑是將DNA四面體納米材料負載于間充質干細胞外泌體表面而得到的外泌體制劑Exo-TDN；或者

所述外泌體制劑是將DNA四面體納米材料負載于間充質干細胞外泌體后，通過交聯劑磷脂聚乙二醇馬來酰亞胺，將心肌特異性靶向肽PCM修飾到外泌體表面而得到的外泌體制劑PCM-Exo-TDN；所述DNA四面體納米材料的四條鏈的堿基序列為：

S1：GAGCGTTAGCCACACACACAGTC-Cholesterol，

S2：TTAGGCGAGTGTGGCAGAGGTGT-Cholesterol，

S3：CGCCTAAACAAGTGGAGACTGTG-Cholesterol，

S4：AACGCTCACCACTTGAACACCTC；

所述間充質干細胞為人或鼠的間充質干細胞；所述間充質干細胞外泌體為提取的3-5代傳代培養細胞的外泌體。

2.權利要求1所述的外泌體制劑的制備方法，其特征是，包括以下步驟：

（a）取間充質干細胞進行傳代培養，得到3-5代傳代培養的間充質干細胞；

（b）當間充質干細胞的融合程度達到70-80%時，除去原有的培養基，換成無血清培養基，培養12-24h后，收集上清液，然后進行離心、過濾，提取外泌體；

（c）預先制備DNA四面體納米材料，然后將間充質干細胞外泌體分散于PBS中，加入制備的DNA四面體納米材料，在37℃下孵育0.5-3h，其中，間充質干細胞外泌體與DNA四面體納米材料的質量比為1:2-5，之后迅速放到冰上震蕩0.5-2h，最后用超濾離心管進行離心，即得到外泌體制劑Exo-TDN；

（d）取心肌特異性靶向肽PCM、磷脂聚乙二醇馬來酰亞胺DSPE-PEG-MAL溶于水中，于2-4℃攪拌過夜，然后轉入透析袋中，每3-5h換一次水，透析24-36h后，進行冷凍干燥，得到DSPE-PEG-PCM，取步驟（c）制備的Exo-TDN分散于PBS中，然后加入DSPE-PEG-PCM，于2-4℃攪拌3-5h后，用超濾離心管進行離心，除去未反應的DSPE-PEG-PCM，即得到外泌體制劑PCM-Exo-TDN。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，步驟（b）中，將細胞培養上清液在10000rpm離心20-40min，然后用0.22μm的濾膜過濾，再加入細胞培養上清液1/3體積的外泌體提取試劑，于2-4℃孵育過夜，之后在2-4℃，轉速10000g條件下離心20-40min，取沉淀，用PBS重懸，即得到外泌體。

4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，步驟（c）中，將等摩爾量的四條DNA鏈在緩沖液中混合均勻，然后在95℃下保持5-15min，然后冷卻至4℃，即得到DNA四面體納米材料。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征是，步驟（c）中，所述緩沖液為20mM Tris、16mM MgCl₂、pH8.0。

6.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，步驟（d）中，心肌特異性靶向肽PCM與磷脂聚乙二醇馬來酰亞胺DSPE-PEG-MAL的質量比為1:2，透析袋為3500Da透析袋，所述 Exo-TDN與加入的DSPE-PEG-PCM的質量比為1:2，超濾離心的條件為通過100KDa超濾管于2-4℃、轉速4500g下離心15-30min。

7.權利要求1所述的外泌體制劑在制備針對腫瘤化療的解毒修復藥物中的應用。