[發明專利]一種間充質干細胞的分離和培養方法及制劑

在審

• 申請號: 202110696335.1
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113322231A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 趙瑩;朱艷麗;聶蘇秦
• 申請（專利權）人: 陜西九州生物醫藥科技集團有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 孫騰

本發明公開了一種間充質干細胞的分離和培養方法及制劑，屬于生物技術領域。該間充質干細胞的分離方法包括以下步驟：將滑膜組織剪碎，并置于完全培養基中后，再添加膠原酶溶液進行消化、震蕩分散，得到沉降組織和第一上清液；將沉降組織置于完全培養基中進行震蕩分散，重復兩遍，所得上清液均與第一上清液進行混合，再對上清液進行過濾，得到濾液；將濾液進行離心處理，棄上清，分離得到原代間充質干細胞。將原代間充質干細胞通過2D純化培養后進行3D擴增培養，獲得大量純度高、分化能力強的滑膜間充質干細胞。本發明提供的間充質干細胞的分離和培養方法，采用的試劑較少，避免了多種酶混合消化對細胞造成的多次損傷。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是一種間充質干細胞的分離和培養方法及制劑。

背景技術

骨關節炎為中老年常見病，骨關節炎嚴重降低了老年人的生活質量，同時也給社會經濟醫療保健帶來沉重的負擔，研究骨關節炎的治療方法已成為解決我國民生大計的重要內容之一。骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨的磨損、破壞、丟失，并伴有關節周圍骨質增生的一種退行性疾病，主要表現為關節疼痛及功能障礙，目前的治療手段僅起到緩解的效果，不能有效逆轉其進展。

研究發現，OA患者滑膜中廣泛分布著表達間充質干細胞(mesenchymal stemcells ，MSCs)標志物的細胞，而在健康關節滑膜中這種細胞僅分布在襯里層。已證實，滑膜間充質干細胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）除具有MSCs的共性外，相比其他來源的MSCs有更好的成軟骨分化能力，以及更強的集落形成和擴增能力。此外，滑膜組織具有很強的自我修復能力，即便受到一定的手術創傷或化學損傷，滑膜組織也能夠完全恢復，且不會對關節的正常結構和功能等產生十分明顯的影響。所以，利用SMSCs治療OA，采集標本時，以不損傷患者關節正常結構和功能為前提，可以在微創手術（關節鏡）過程中獲得所需的滑膜組織。動物來源（包括大鼠滑膜和兔滑膜等）的SMSCs已應用于同種異體組織工程動物模型的實驗研究中，在動物軟骨缺損最深層，SMSCs分化為骨細胞，次深層分化為肥大的軟骨細胞，且新生組織與固有軟骨融合良好，組織學評分逐漸升高；也有報道移植SMSCs后，SMSCs分泌了大量軟骨基質，骨膜處的軟骨祖細胞能分泌少量軟骨基質。進一步研究發現滑膜間充質干細胞修復形成的組織是透明軟骨而非纖維軟骨，并且滑膜間充質干細胞更能適應關節內的微環境。說明SMSCs對于軟骨損傷具有天然且有效的修復能力，是徹底根治OA的極為有效的理想選擇，有必要對其進行提取制備及深入研究。

目前對于SMSCs的研究很少，文獻報道的分離提取SMSCs的方法不盡相同，也沒有統一的分離制備標準，且現有分離提取SMSCs的方法存在培養周期長，產量低，所采用試劑較多等問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種間充質干細胞的分離和培養方法及制劑，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：

一種間充質干細胞的分離方法，其包括以下步驟：

將滑膜組織剪碎，并置于完全培養基中后，再添加膠原酶溶液進行消化、震蕩分散，得到沉降組織和第一上清液。

將沉降組織置于完全培養基中進行震蕩分散，得到上清液與第一上清液混合。

將沉降組織再次置于完全培養基中進行震蕩分散，得到上清液與上述上清液混合。

對所得上清液進行過濾，得到濾液。

將濾液進行離心處理，棄上清，得到原代間充質干細胞。

作為本發明實施例的一個優選方案，所述膠原酶溶液的制備方法包括以下步驟：將膠原酶溶解于完全培養基中后，再經濾膜過濾，得到所述膠原酶溶液。

作為本發明實施例的另一個優選方案，所述膠原酶溶液中，膠原酶的質量與完全培養基的體積的比值以g/mL計為(0.5~1.5):100。