[發明專利]一種自由流等電聚焦電泳緩沖體系

在審

• 申請號: 202110696211.3
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113563412A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 馬艷;師要輝;吳清靈;馬校衛;張思齊;沈治峰;袁新玲
• 申請（專利權）人: 上海藍析生物技術有限公司
• 主分類號: C07K1/28
• 分類號: C07K1/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種自由流等電聚焦電泳緩沖體系，包括：緩沖體系組分，所述緩沖體系組分設有9個，9個組分包括1個陽極電解液、1個陽極占位緩沖液、5個分離緩沖液和1個陰極占位緩沖液、1個陰極極電解液，所述緩沖體系組分中不含甲基纖維素等大分子物質，pH組成為5?10.5，等電點在200?10000us之間。本緩沖體系在異構體制備完成后可采用超濾濃縮管進行回收，回收率可以達到90％以上；本緩沖體系不僅靈敏度較高可以達到0.03pH單位，而且可以明顯提高異構體的回收率，降低異構體的后續純化時間。

技術領域

本發明屬自由流等電聚焦電泳技術領域，具體涉及一種自由流等電聚焦電泳緩沖體系。

背景技術

電荷異構體分析是生物治療蛋白質的一項監管要求。這些大的異質分子在生產過程中歷經多種酶促翻譯后修飾，例如糖基化和賴氨酸切斷。此外，在純化和儲存過程中可發生多種化學修飾，例如氧化或脫氨。自由流電泳是制備蛋白質藥物電荷異構體的最佳方法。

自由流電泳(Free Flow Electrophoresis，FFE)是半制備型分離技術，具有可連續分離、多種分離模式、無固定支持介質和分離條件溫和等優勢，特別適用于生物材料的分離純化和制備。自由流等電聚焦電泳(IEF-FFE)利用連續流動的兩性電解質溶液，在分離室內的電場方向形成線性pH梯度。樣品隨溶液縱向流動，并在電場作用下發生橫向偏轉，達到其等電點處不再橫向移動，被強制聚焦在某位置，不受擴散和對流的影響，僅在溶液流動方向移動。具有不同等電點的蛋白質或肽等良性物質可通過IEF-FFE達到分離。由于電荷異構體的產生會影響藥物的活性，因此現在制備電荷異構體主要是進行活性的分析，但是采用IEF-FFE制備電荷異構體后的緩沖液中存在甲基纖維素或羥甲基丙基纖維素等大分子，這些分子不僅影響異構體的濃縮回收和后續的活性分析，現在常用的純化異構體的方法是進行親和層析，由于酸性和堿性異構體含量較少，在親和層析過程中回收過低而造成實驗失敗。

發明內容

本發明的目的在于提供一種自由流等電聚焦電泳緩沖體系，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種自由流等電聚焦電泳緩沖體系，包括：緩沖體系組分，所述緩沖體系組分設有9個，9個組分包括1個陽極電解液、1個陽極占位緩沖液、5個分離緩沖液和1個陰極占位緩沖液、1個陰極極電解液，所述緩沖體系組分中不含甲基纖維素等大分子物質，pH組成為5-10.5，等電點在200-10000us之間。

優選的，所述陽極電解液為100mM硫酸，400mM吡啶乙醇。

優選的，所述陽極占位緩沖液為100mM磷酸，400mM吡啶乙醇，50mM乙二酸。

優選的，5個分離緩沖液分別設為分離緩沖液Ⅰ、分離緩沖液Ⅱ、分離緩沖液Ⅲ，分離緩沖液Ⅳ和分離緩沖液Ⅴ，所述分離緩沖液Ⅰ為20M HIBA，20mMES，20mM HEPES，1.5％pharmalyte8-10.5，1％pharmalyte 5-8，0.5％pharmalyte 2.5-5；所述分離緩沖液Ⅱ為100mM牛磺酸，2％pharmalyte8-10.5，1％pharmalyte 5-8；所述分離緩沖液Ⅲ為1.5％pharmalyte8-10.5，0.1％pharmalyte 5-8；所述分離緩沖液Ⅳ為2％pharmalyte8-10.5，0.1％pharmalyte 5-8，50mM乙醇胺；所述分離緩沖液Ⅴ為300mM KOH，100mM乙醇胺。

優選的，所述陰極占位緩沖液為150mM KOH，50mM乙醇胺，400mM EACA。

優選的，所述陰極電解液為100mM NaOH，400mM EACA。

本發明的技術效果和優點：本緩沖體系在異構體制備完成后可采用超濾濃縮管進行回收，回收率可以達到90％以上；本緩沖體系不僅靈敏度較高可以達到0.03pH單位，而且可以明顯提高異構體的回收率，降低異構體的后續純化時間。

附圖說明