[發明專利]一種生物化學法制備索馬魯肽的方法

在審

• 申請號: 202110695072.2
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113278061A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 葉建仁;何偉;陳本順;石利平;江濤;徐春濤;邱磊;潘聲成;尹斌;何義
• 申請（專利權）人: 南京林業大學;南京歐信醫藥技術有限公司
• 主分類號: C07K14/605
• 分類號: C07K14/605;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12N15/16;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 張洪年

1.生物化學法制備索馬魯肽的方法，其特征在于，所述方法的合成路線如下：

其中MI肽鏈通過化學合成法合成；MII肽鏈通過大腸桿菌發酵制備而成；MIII肽鏈通過化學合成法合成；

MI肽鏈、MII肽鏈、MII肽鏈經化學法連接形成索馬魯肽；

其中MII肽鏈為Lys²⁶Arg³⁴GLP-1(10-37)肽鏈，其DNA序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其氨基酸排列如下所示：

2.根據權利要求1所述的生物化學法制備索馬魯肽的方法，其特征在于，所述MII肽鏈通過融合蛋白表達，所述融合蛋白的DNA序列包含含有His-tag 基因序列的TrxA DNA序列和如SEQ ID NO.3所示的MII鏈DNA序列。

3.根據權利要求2所述的生物化學法制備索馬魯肽的方法，其特征在于，所述融合蛋白中還添加有酶切位點，優選地該酶切位點為TEV酶切位點，改進后優選的融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根據權利要求1所述的生物化學法制備索馬魯肽的方法，其特征在于，用于表達融合蛋白的重組表達載體，該重組表達載體含有編碼融合蛋白的編碼基因SEQ ID NO.1。

5.根據權利要求4所述的生物化學法制備索馬魯肽的方法，其特征在于，所述的重組表達載體為環狀載體，其啟動子為T7promoter，操縱子為乳糖操縱子，該載體序列如SEQ IDNO.2所示。

6.根據權利要求1所述的生物化學法制備索馬魯肽的方法，其特征在于，本發明所公開的大腸桿菌優選為E.coli BL21(DE3)。

7.根據權利要求1所述的生物化學法制備索馬魯肽的方法，其特征在于，索馬魯肽中間體Lys²⁶Arg³⁴GLP-1(MII肽鏈)的制備方法，包括以下步驟：

S1：合成包含含有His-tag基因的TrxA DNA序列和TEV酶切位點序列和MII鏈序列的編碼基因，

S2：將編碼基因連接到表達載體中，

S3：將帶有編碼基因的重組表達載體轉化入大腸桿菌，構建重組工程菌；

S4：將重組工程菌接種、培養，誘導融合蛋白表達；

S5：收集包涵體；

S6：酶切去標簽獲得具有MII肽鏈的多肽粗品。

8.根據權利要求7所述的生物化學法制備索馬魯肽的方法，其特征在于，在步驟S2與S3之間還包含有融合蛋白目的基因確認步驟；進一步優選的，該確認采用PCR確認方法，具體為：設計上下游引物F：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'R：5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。PCR條件為：98℃5min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，36個循環；PCR擴增體系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，滅菌的雙蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；PCR產物在瓊脂糖凝膠制作的膠板上電泳確認后，送檢測序，確認融合蛋白DNA序列是否無誤。