[發明專利]基因位點定點插入基因條件性過表達模型構建方法

在審

• 申請號: 202110693413.2
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113493807A
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發明（設計）人: 王斌;王志飛;張現娟;王雅碩;王韻陽
• 申請（專利權）人: 青島大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;A01K67/027;C12N15/12
• 代理公司: 北京云嘉湃富知識產權代理有限公司 11678
• 代理人: 卞永如

本發明屬于動物模型構建技術領域，公開了一種基因位點定點插入基因條件性過表達模型(Rosa26?LSL?IE2)構建方法，通過體外轉錄的方式，獲得Cas9mRNA和gRNA；通過In?Fusion cloning的方法構建同源重組載體donor vector；將Cas9mRNA、gRNA和donor vector顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，獲得F0代小鼠；PCR擴增及測序鑒定陽性的F0代小鼠與C57BL/6J小鼠交配獲得陽性F1代小鼠。本發明IE2轉基因鼠的建模成功克服種屬特異性，構建了能穩定持續表達ie2的機體環境。

技術領域

本發明屬于動物模型構建技術領域，尤其涉及一種基因位點定點插入基因條件性過表達模型構建方法。

背景技術

目前，人巨細胞病毒(HCMV)屬于皰疹病毒β亞科，為線狀雙鏈DNA病毒，在人群中感染率高達100％，具有潛伏活化的生物學特性。正常人感染時表現為無癥狀的隱性或潛伏感染，而一旦人體免疫機能發生重大變化時如腫瘤、HIV感染、器官移植和新生兒等，HCMV即可從潛伏感染中活化而發生原發性、繼發性的增殖感染，引起嚴重的臨床癥狀甚至死亡。先天性及圍產期病毒的感染是出生缺陷的主要病毒原因，主要導致中樞性神經系統先天性畸形。神經干細胞、神經元及神經膠質細胞對HCMV普遍易感，故胚胎期HCMV感染常常導致嚴重的CNS畸形發生。胎兒在感染HCMV后，僅10％～15％有明顯的癥狀。而90％以上的嬰兒出生時可能呈隱性感染，無癥狀，數年后，逐步出現耳聾、智力遲鈍等遲發性神經系統損傷。由于種屬特異性，迄今為止對HCMV在機體內長期持續性感染及其與疾病關系的分子機制尚未闡明。因此，亟需一種能夠有效闡明HCMV在機體內長期持續性感染及其與疾病關系的分子機制的動物模型。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：由于種屬特異性，迄今為止對HCMV在機體內長期持續性感染及其與疾病關系的分子機制尚未闡明。

解決以上問題及缺陷的難度為：由于種屬特異性，先前對HCMV感染造成神經系統損傷機制的研究僅限于體外。由于體外環境不能完全模擬機體內環境，所以對先天性HCMV造成神經系統疾病的機制的研究具有局限性。為了更好地闡明先天HCMV感染機體內造成神經系統損傷的分子機制，我們構建了Rosa26定點IE2基因條件性過表達模型,簡寫為：Rosa26-LSL-IE2。

解決以上問題及缺陷的意義為：該模型的建模成功克服了HCMV種屬特異性，構建了能穩定持續表達ie2的機體環境，這將有助于進一步闡明HCMV先天性感染導致神經系統疾病的機制和為疾病的防治提供理論依據。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種基因位點定點插入基因條件性過表達模型構建方法。

本發明是這樣實現的，一種基因位點定點插入基因條件性過表達模型構建方法，所述基因位點定點插入基因條件性過表達模型構建方法包括：采用CRISPR/Cas9技術，通過同源重組的方式，在Rosa26基因位點定點插入CAG-LSL-IE2-WPRE-pA表達框，建立IE2轉基因鼠模型。

進一步，所述Rosa26定點IE2基因條件性過表達模型構建方法包括以下步驟：

步驟一，通過體外轉錄的方式，獲得Cas9 mRNA和gRNA(為定位酶切位點及準確切割做準備)；

步驟二，通過In-Fusion cloning的方法構建同源重組載體donor vector(構建表達載體)；

步驟三，將Cas9 mRNA、gRNA和donor vector顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，獲得F0代小鼠(目的基因的插入)；

步驟四，PCR擴增及測序鑒定陽性的F0代小鼠與C57BL/6J小鼠交配獲得陽性F1代小鼠(轉基因陽性鼠獲取)。

進一步，步驟一中，所述gRNA的基因序列如SEQ ID NO：1所示。