[發(fā)明專利]一種多器官細(xì)胞基因突變檢測基因編輯小鼠模型的構(gòu)建及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110690906.0
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113412820A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李海山;謝文平;沈國林;宋乃寧;趙潺
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/85;C12N15/90;C12N15/62;C12N15/55;G01N33/50
• 代理公司: 北京兆君聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11333
• 代理人: 劉俊玲

本發(fā)明提供一種CD59基因編輯小鼠模型，它是定點(diǎn)敲入CD59?增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)序列片段的小鼠。本發(fā)明還提供構(gòu)建CD59?EGFP基因編輯小鼠模型的方法，是利用CRISPR?Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠基因ROSA26位點(diǎn)定點(diǎn)敲入CD59?EGFP基因序列的方法，包括：設(shè)計(jì)并獲得向?qū)NA，制備向?qū)NA與Cas9蛋白混合物；構(gòu)建CD59?EGFP打靶載體；顯微共注射與F0代小鼠獲得，F(xiàn)1代小鼠獲得；CD59?EGFP打靶載體中，CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明的基因編輯小鼠模型對致突變化學(xué)物有應(yīng)答，分離其肝細(xì)胞、生殖細(xì)胞，在熒光顯微鏡下通過綠色熒光可以顯示CD59胞膜定位，可用于化學(xué)物的多器官細(xì)胞致突變性檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多器官細(xì)胞基因突變檢測基因編輯小鼠模型，以及所述模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

CD59是一種分子量18～20kDa的膜性調(diào)節(jié)蛋白。CD59由103個(gè)氨基酸殘基組成，含有單一的N端糖基化位點(diǎn)，其C端借糖化磷脂酰肌醇錨固定于細(xì)胞表面。CD59分布甚廣泛，已證明皮膚、肝、腎、胰、肺、唾液腺、神經(jīng)系統(tǒng)、胎盤以及各種血細(xì)胞(紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及血小板)和精子上均有表達(dá)。在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥等貧血疾病中紅細(xì)胞表達(dá)缺陷，臨床上常用做該類疾病的生物標(biāo)志物。已有研究提示致突變化學(xué)物可以導(dǎo)致外周血細(xì)胞表面CD59表達(dá)減少。

人CD59基因定位于第11號染色體短臂，與小鼠CD59有同源性。因此，構(gòu)建一種導(dǎo)入熒光蛋白融合表達(dá)的CD59基因編輯小鼠，在熒光顯微鏡下直接觀察細(xì)胞膜表面的熒光強(qiáng)度，方便快捷反映多種器官細(xì)胞的基因突變，具有其優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)熒光蛋白融合CD59的基因編輯小鼠模型，應(yīng)用于多器官細(xì)胞基因突變的檢測。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供構(gòu)建所述基因編輯小鼠模型的方法。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述基因編輯小鼠模型分離其肝細(xì)胞、生殖細(xì)胞，在不同器官、細(xì)胞類別(體細(xì)胞、生殖細(xì)胞)基因突變檢測中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

首先，提供一種CD59基因編輯小鼠模型，它是定點(diǎn)敲入CD59-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)序列片段的小鼠。

本發(fā)明所述的CD59基因編輯小鼠模型對致突變化學(xué)物有應(yīng)答。其外周血細(xì)胞、分離獲得的肝細(xì)胞、生殖細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光分布于胞膜，給予小鼠致突變化學(xué)物，胞膜綠色熒光強(qiáng)度減弱。

本發(fā)明還提供一種構(gòu)建CD59基因編輯小鼠模型的方法，是利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠基因ROSA26位點(diǎn)定點(diǎn)敲入CD59-EGFP基因序列的方法，包括：設(shè)計(jì)并獲得向?qū)NA，制備向?qū)NA與Cas9蛋白混合物；構(gòu)建CD59-EGFP打靶載體；顯微共注射與F0代小鼠獲得，F(xiàn)1代小鼠獲得。

本發(fā)明優(yōu)選的所述構(gòu)建方法中，所述的CD59-EGFP打靶載體，其中CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明最優(yōu)選的所述構(gòu)建方法，具體包括如下步驟：

1)設(shè)計(jì)并獲得CD59-EGFP向?qū)NA；

2)將1)所得到的向?qū)NA與Cas9蛋白共同孵育，制備Cas9/向?qū)NA混合物；

3)構(gòu)建打靶載體，利用In-Fusion克隆技術(shù)構(gòu)建CAG-Kozak-CD59-GS linker-EGFP-polyA同源重組載體，其中所述的CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的EGFP核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；