[發明專利]褐藻膠裂解酶AlyPL17、截短體及其應用

有效

• 申請號: 202110690279.0
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113308455B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 朱本偉;李謙;姚忠;熊強;孫蕓
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/02;C12P19/12;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 肖明芳

本發明公開一種褐藻膠裂解酶AlyPL17及其截短體，并進一步將AlyPL17及其截短體的基因克隆轉化到大腸桿菌表達載體上，獲得可異源表達的大腸桿菌重組菌株，用該菌株異源表達相應的褐藻膠裂解酶。酶學性質表征結果表明，AlyPL17及其截短體的最適溫度45℃，最適pH為9.0,并且該酶擁有較高的比活力。從作用模式上來看該酶的全酶AlyPL17采用混合作用模式，而兩端截短體采用內切作用模式，表明該酶的獨特作用模式是由兩端截短體協同作用造成的。本發明對解析混合作用模式褐藻膠酶具有極大的參考價值，且所獲得的褐藻膠裂解酶AlyPL17可作為褐藻資源向生物能源轉化的潛在工具。

技術領域

本發明屬于基因工程技術與蛋白表達領域，具體涉及一種褐藻膠裂解酶基因的克隆表達及其固定化。

背景技術

全球能源日益緊張，生物質能源成為研究的熱點。玉米等糧食作為第一代生物質資源在大規模應用的同時會帶來糧食短缺等問題。而秸稈木質素等第二代生物質資源，由于結構復雜，難以利用在一定程度上限制了其工業化應用。海洋藻類具有分布廣泛、不需要淡水資源、不與人爭糧食、組成成分中含有可發酵糖類的特點，因此，海洋藻類正逐漸成為第三代生物質資源。

褐藻膠作為褐藻細胞壁的主要成分，是由β-D-甘露糖醛酸(M)以及它的C5差向異構體α--L古羅糖醛酸(G)兩種單體組成的酸性多糖。褐藻膠裂解酶可以通過消除反應將其降解成不飽和單糖以及寡糖。根據序列相似性來看，褐藻膠裂解酶可以劃分到12個多糖裂解酶家族，即PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36以及PL39家族。根據底物特異性來分褐藻膠裂解酶可以分為polyM專一型褐藻膠裂解酶、polyG專一型褐藻膠裂解酶以及雙功能酶。根據降解模式來分，褐藻膠裂解酶可以分為內切型褐藻膠裂解酶，采用這種作用模式的褐藻膠裂解酶將褐藻膠多糖降解成寡糖。外切型褐藻膠裂解酶，采用這種作用模式的褐藻膠裂解酶可以將褐藻膠降解成不飽和單糖。不飽和單糖可以通過一系列降解過程之后被微生物利用代謝產乙醇。因此將褐藻資源轉化成生物能源最關鍵的一步就是將褐藻膠降解成不飽和單糖。

目前已經得到表征的外切型褐藻膠裂解酶的活性在20-40U/mg之間，單糖轉化率較很低。這種情形限制了褐藻膠的生物能源轉化。因此，挖掘具有較高活性的外切型褐藻膠裂解酶，并且解析其作用模式具有十分重要的意義。

發明內容

發明目的：本發明的一個目的在于提供一種具有較高活性的外切型褐藻膠裂解酶。

本發明的另一個目的在于提供上述褐藻膠裂解酶的截短體，并對該褐藻膠裂解酶的獨特混合作用模式進行解析。

本發明還要解決的問題在于提供上述褐藻膠裂解酶及其截短體的編碼基因及應用。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種褐藻膠裂解酶AlyPL17，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，共695個氨基酸殘基。本發明的褐藻膠裂解酶AlyPL17來源Pedobacter hainanensis NJ-02(該菌株信息公開于B.Zhu,et al.,Int.J.Biol.Macromol.(2017)中)。

上述褐藻膠裂解酶AlyPL17，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，為2085bp。

本發明進一步提出了褐藻膠裂解酶AlyPL17的截短體AlyPL17-N，截短體AlyPL17-N是由全酶截取N端結構域1-346共346個氨基酸序列構成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發明還提出了褐藻膠裂解酶AlyPL17的截短體AlyPL17-C，截短體AlyPL17-C是由全酶截取C端結構域347-695共349個氨基酸序列構成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。