[發明專利]DSC2基因敲除小鼠模型的構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110690197.6
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113412819A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 戴宇翔;龔惠;葛均波;鄒妍
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/12
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 范艷靜

本發明提供了一種DSC2基因敲除小鼠模型的構建方法和應用，DSC2基因敲除小鼠模型在制備預防和治療右心病、監測右心室舒張和收縮、制備凋亡通路調控試劑和藥物或者制備纖維化通路調控試劑和藥物中的應用；本發明通過CRISPR?Cas9技術在C57BL/6J小鼠基礎上的構建DSC2缺失突變型小鼠，DSC2敲除的小鼠能有效地誘導出右心室心肌病，可用于右心室心肌病研究的小鼠模型；單純地敲除DSC2基因便可隨著小鼠年齡的增長，小鼠自身出現右心室擴大，右心室心肌纖維化，以及中晚期右心室心力衰竭等右心室心肌病的表現，故該小鼠模型可以作為后續對右心室心肌病的分子機制研究中一種有效的模型。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種DSC2基因敲除小鼠模型的構建方法和應用。

背景技術

1905年Osler首次描述以右心室肌受累為主的疾病以來，先后報道了羊皮紙心臟、Uhls畸形、右室發育不良和心律失常源性右室發育不良。由于這些疾病均以右室心肌受累為主，病因和發生機制不清楚，1988年Thiene把它們統稱為右心室心肌病(RVC)。

右心室心肌病臨床表現差異較大，部分患者無任何臨床表現，心臟也不擴大，僅在尸檢或手術時才被發現，但絕大多數患者可出現心悸、易疲勞、胸悶、頭暈及暈厥，甚至突發猝死。少數患者可發生右心衰竭，低血壓休克，該類患者缺乏特異性體征，常有心界擴大，胸骨左下緣可聞及1-2級收縮期雜音，出現病理性第三、第四心音，第二音寬分裂及心動過速等，也無任何心臟體征。

超聲心動圖、心臟核素與心血管造影檢查是確診本病的可靠方法。主要改變為右室擴大，游離壁運動減弱或消失，室間隔與左室后壁同向運動，心尖部，膈面及漏斗部前壁可見憩室狀或瘤樣膨出，肌小梁消失。左室正常或被壓后方而致心腔縮小，偶可見左室輕度增大，三尖瓣位置正常或伴反流。

根據病理尸檢所見，病變可呈灶性或彌漫性，主要累及右心室前壁漏斗部(肺動脈圓錐)，心尖部及后下壁，三者構成了所謂的“發育不良三角”，右心室常呈球形增大，心腔擴張，可有室壁瘤形成，切面心室肌壁層不同程度變薄。鏡下：以右心室心肌不同程度地被脂肪組織或纖維組織替代為特征，病變以右心室游離壁和心尖部較為明顯，殘存的心肌纖維萎縮，呈不規則索團狀。部分病例可見灶性心肌壞死，炎癥的反應及纖維化改變。

研究發現，右心室心肌病的心肌細胞壞死可能是一種由遺傳決定的程序性細胞凋亡，持續性凋亡可導致心肌細胞進行性喪失而被纖維脂肪組織替代，這一學說很引人注意，因為它對典型的右心室受累做出了合理的解釋。

橋粒是細胞間連接的主要方式，對維持上皮組織的正常形態和功能具有重要意義。橋粒膠蛋白(DSC)為鈣粘蛋白超家族成員之一，與橋粒芯糖蛋白(DSG)合稱為橋粒鈣粘素(DC)，是組成橋粒的重要蛋白成分。人類橋粒鈣黏素基因位于18號染色體長臂1區2帶，表達DSC1-3與DSG1-4兩組蛋白。與傳統的鈣黏素相似，DC具有完整的跨膜糖蛋白結構，其胞外部分包含氨基酸識別序列，以異二聚體的形式完成細胞間橋粒連接；而胞內區與胞漿內的附著板相連，進而連接細胞骨架的角蛋白成分。

DSC2蛋白是一種鈣黏蛋白，屬于跨膜蛋白，是橋粒的重要成分，在心肌、骨骼肌和消化道上皮中高表達，而橋粒是心肌細胞之間的重要連接，是閏盤的關鍵組成部分，橋粒不但可維持心肌組織結構和功能的完整性，增強心肌細胞承受機械應力時的黏附作用，還廣泛參與到調控心肌細胞內外的信號轉導途徑。通過對DSC2蛋白晶體結構解析發現，DSC2可形成二聚體結構，早期橋粒的裝配過程中，DSC2蛋白形成同源二聚體，而成熟橋粒的裝配過程中DSC2蛋白和DSG2蛋白形成異源二聚體。其他橋粒相關蛋白(PKP2，DSP，DSG2和JUP)等突變已經證實和心肌病特別是ARVC等發病機制有關，主要是影響心肌細胞的橋粒以及閏盤結構從而引起心肌病變有關。既往已有報道相關橋粒蛋白(PKP2、DSP、DSG2和JUP)移碼突變或無意突變造成的小鼠胚胎致死。