[發明專利]一種醛醇氧化酶二聚體及其制備方法

在審

• 申請號: 202110689676.6
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113403291A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 陳國;張文偲;郭洪偉;趙珺
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C07K19/00;C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 陳雪瑩

1.一種醛醇氧化酶二聚體，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如權利要求1所述的醛醇氧化酶二聚體的制備方法，其特征在于，其制備步驟包括：

(1)將SpyTag/SpyCatcher基因與p53dim基因融合后與載體連接，得到重組質粒pETDuet-TXC，所述釀膿鏈球菌Streptococcuspyogenes來源的SpyTag/SpyCatcher的核苷酸序列如SEQ ID NO.4，所述腫瘤抑制因子來源的p53二聚結構域的核苷酸序列如SEQ IDNO.3；

(2)以質粒pETDuet-AldO為模板，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2，用P1和P2為引物擴增得到含AldO的目的基因片段，

P1核苷酸序列為：GAGCTCATGAGCGACATCACCGTTAC；

P2核苷酸序列為：GTCGACAGAACCTGAGCCTGAGCCCGCCAGCACACCGCGC；

(3)以質粒pETDuet-TXC為模板，通過酶切連接將目的片段AldO連接至質粒pETDuet-TXC上，得到重組質粒pETDuet-TXAC；

(4)重組質粒pETDuet-TXAC轉化到大腸桿菌JM109，經菌落PCR篩選陽性轉化子篩選后，獲得基因工程菌pETDuet-TXAC JM109，再將重組質粒pETDuet-TXAC轉化E.coli BL21(DE3)，得到基因工程菌pETDuet-TXAC BL21(DE)；

(5)將基因工程菌pETDuet-TXAC BL21(DE)接種于TB液體培養基中，37℃，200-220rpm培養12-16h；按1-2％的接種量轉接到TB培養基中，先于30℃、200-220rpm，培養3-5h直至600nm處的光密度值達到0.4至0.8時，加入終濃度為1mM異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導，16-18℃、200-220rpm，培養20-24h；

(6)發酵液于10000rpm，4℃條件下離心10min，收集沉淀，用重懸液重懸菌體，重懸液組成：20mM Na₂HPO₄、20mM咪唑、500mM NaCl、1mM DTT、0.5mM PMSF，pH 7.4，后經超聲破碎后離心，上清即為醛醇氧化酶二聚體的粗酶液，采用Ni-NTA親和層析以及SEC兩步純化得到醛醇氧化酶二聚體catAldO。

3.一種表達如權利要求1所述的醛醇氧化酶二聚體的基因工程菌的構建方法，其特征在于，構建步驟包括：

(1)將SpyTag/SpyCatcher基因與p53dim基因融合后與載體連接，得到重組質粒pETDuet-TXC，所述釀膿鏈球菌Streptococcuspyogenes來源的SpyTag/SpyCatcher的核苷酸序列如SEQ ID NO.4，所述腫瘤抑制因子來源的p53二聚結構域的核苷酸序列如SEQ IDNO.3；

(2)以質粒pETDuet-AldO為模板，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2，用P1和P2為引物擴增得到含AldO的目的基因片段，

P1核苷酸序列為：GAGCTCATGAGCGACATCACCGTTAC；

P2核苷酸序列為：GTCGACAGAACCTGAGCCTGAGCCCGCCAGCACACCGCGC；

(3)以質粒pETDuet-TXC為模板，通過酶切連接將目的片段AldO連接至質粒pETDuet-TXC上，得到重組質粒pETDuet-TXAC；

(4)重組質粒pETDuet-TXAC轉化到大腸桿菌JM109，經菌落PCR篩選陽性轉化子篩選后，獲得基因工程菌pETDuet-TXAC JM109，再將重組質粒pETDuet-TXAC轉化E.coli BL21(DE3)，得到一種表達醛醇氧化酶二聚體的基因工程菌pETDuet-TXAC BL21(DE)。