[發明專利]桑花葉型矮縮相關病毒MMDaV侵染性克隆載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110689243.0
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113403335A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 楊秀玲;周雪平;孫少雙
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/34;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

本發明公開了一種桑花葉型矮縮相關病毒MMDaV侵染性克隆載體及其構建方法和應用。在獲得桑花葉型矮縮相關病毒基因組全序列的基礎上，將2.0個正向重復的桑花葉型矮縮相關病毒全長基因組構建在植物表達載體pBinPLUS上，通過電擊的方法轉入農桿菌菌株，獲得以農桿菌介導的對植物有侵染能力的病毒載體。采用本發明提供的侵染性克隆載體能在本氏煙上引起壞死反應，操作簡單，重復性好；利用本發明提供的侵染性克隆載體可有效用于植物抗病反應分析。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別是涉及一種單鏈DNA病毒，雙生病毒科，桑花葉型矮縮相關病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV)的侵染性克隆構建。

背景技術

桑花葉型矮縮相關病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV)是嚴重影響桑樹的生長和桑葉產量的一種單組份雙生病毒，該病害發生時，桑樹呈現矮化、葉片黃化皺縮、等癥狀。MMDaV的基因組是大小為2952nt的單鏈環狀DNA分子，病毒鏈含有5個ORF(V1、V2、V3、V4和V5)：V1可能編碼衣殼蛋白，V2編碼的蛋白為RNA沉默抑制子，V3、V4和V5的序列與已知的雙生病毒序列的同源性很低，其編碼的蛋白的功能還不明確；互補鏈含有2個ORF(C1和C1：C2)，其編碼的蛋白可能與病毒的復制有關。MMDaV的病毒鏈與互補鏈之間為基因間隔區，含有病毒復制和轉錄的起始位點。目前，MMDaV的生物學特性和致病機理尚不明確。

植物病毒的侵染性克隆是植物病毒學研究的基礎工具。利用突變、重組等分子操作，可在體外對病毒基因組進行修飾和改造；通過分析重組病毒的表型和特性變化，可以研究病毒基因組的結構、明確病毒基因及產物的功能以及理解病毒與宿主的相互作用。此外，病毒的侵染性克隆還可以用于評價植物的抗性，為篩選抗病毒植物以及病毒的防控提供重要手段。

發明內容

本發明的第一個目的是提供MMDaV的侵染性克隆載體及其制備方法。

本發明的第二個目的是提供攜帶MMDaV侵染性克隆的農桿菌菌株及其應用。

本發明以MMDaV為材料，利用分子生物學的方法將2.0個正向重復的MMDaV全長基因組構建在具有高度復制能力的植物表達載體pBinPLUS上，重組載體通過電擊的方法轉入農桿菌菌株，獲得以農桿菌介導的對植物有侵染能力的病毒載體。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案具體如下：

一種MMDaV的侵染性克隆載體，將2.0個正向重復的MMDaV全長基因組構建在具有高度復制能力的植物表達載體pBinPLUS制備得到，所述的MMDaV全序列如SEQ ID NO：6所示。

該MMDaV的侵染性克隆載體的制備方法，包括以下的步驟：

(1)植物總DNA的提取：采用CTAB方法從采集的感染MMDaV的桑樹中提取植物基因組總DNA；

(2)MMDaV全長序列的克隆和測序：利用PCR擴增體系，以含有MMDaV病毒的桑樹DNA為模板，以MMDaV FL/SalI-F和MMDaV FL/KpnI-R(插入SalI和KpnI位點)為引物進行PCR擴增，PCR產物插入到pEasy-T1載體上，篩選得到pEasy T1-MMDaV-PL(含有SalI和KpnI特異性酶切位點)。以MMDaV FL/KpnI-F和MMDaV FL/KpnI-R(插入KpnI位點)為引物擴增目的片段(2952bp)，同樣將PCR產物插入到pEasy-T1載體上，篩選得到pEasy T1-MMDaV-FL(含有KpnI特異性酶切位點)；

所述的引物MMDaV FL/SalI-F、MMDaV FL/KpnI-F和MMDaV FL/KpnI-R的基因序列分別為SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3；