[發(fā)明專利]一種用于分析植物啟動(dòng)子表達(dá)特異性的載體，其制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110684326.0
• 申請(qǐng)日: 2021-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN113430225A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周潔;王栩鳴;楊勇;余初浪;程曄;羊健;嚴(yán)成其;陳劍平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京鼎佳達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 侯蔚寰

1.一種用于分析植物啟動(dòng)子表達(dá)特異性的載體，其特征在于，所述載體的T-DNA區(qū)由5’端向3’端依次包含一個(gè)愈傷組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒和一個(gè)帶有多克隆位點(diǎn)的報(bào)告基因表達(dá)盒；

所述愈傷組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒包括一個(gè)愈傷組織特異啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記基因編碼序列和終止子；

所述愈傷組織特異啟動(dòng)子優(yōu)選為L(zhǎng)OC_Os10g14020基因啟動(dòng)子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述愈傷組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒由5’端向3’端依次包含愈傷組織特異啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記基因編碼序列和終止子；

優(yōu)選的，所述愈傷組織特異啟動(dòng)子的兩端均設(shè)置有AscI酶切位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述愈傷組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的潮霉素基因表達(dá)盒由5’端向3’端依次包含終止子、篩選標(biāo)記基因編碼序列和愈傷組織特異啟動(dòng)子，所述愈傷組織特異啟動(dòng)子反向靠近所述報(bào)告基因編碼序列；

優(yōu)選的，愈傷組織特異啟動(dòng)子的兩端均設(shè)置有AscI酶切位點(diǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述報(bào)告基因選自糖苷水解酶基因、熒光素酶基因或熒光蛋白基因；所述糖苷水解酶基因優(yōu)選β-葡萄糖苷酸酶基因，所述熒光素酶基因優(yōu)選熒火蟲熒光素酶基因，所述熒光蛋白基因優(yōu)選綠色熒光蛋白基因；

所述篩選標(biāo)記基因選自潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、抗生素標(biāo)記基因或抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因，抗生素標(biāo)記基因優(yōu)選抗卡那霉素基因，所述抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因優(yōu)選抗除草劑基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，所述報(bào)告基因表達(dá)盒包括β-葡糖醛酸酶基因編碼序列和胭脂堿合成酶基因終止子。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的載體，其特征在于，所述載體的核苷酸序列如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

7.含有如權(quán)利要求1所述載體的重組質(zhì)粒、宿主菌或轉(zhuǎn)基因株系；

優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒為含有QHB、CYCB、DR5或PR1b啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒。

8.采用如權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的載體在水稻中分析植物基因啟動(dòng)子表達(dá)特異性的方法，至少包括以下步驟：

S1、將目的基因上游啟動(dòng)子片段或合成的啟動(dòng)子片段連入所述載體中的報(bào)告基因前的多克隆位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒；所述目的基因上游啟動(dòng)子片段或合成的啟動(dòng)子片段選自QHB、CYCB、DR5和PR1b啟動(dòng)子中的至少一種；

S2、將所得重組質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，在含有30～60mg/L、優(yōu)選50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷并分化成苗。

9.如權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的載體的制備方法，至少包括以下步驟：

S1、PCR擴(kuò)增各個(gè)載體組件序列，所述載體組件序列包括愈傷組織特異啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記基因編碼序列、報(bào)告基因及終止子；

S2、將各個(gè)DNA片段按照所述載體的排列方式進(jìn)行連接。

10.如權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的載體在分析特異性表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。